目前研究肝脏缺血再灌注损伤通常采用的方法有:(1)对离体或原位肝脏行人工或机械灌注法;(2)肝脏原位热缺血再灌注法;(3)原位肝脏移植法.各种方法均有利弊.临床上,随着取肝技术的日益成熟,热缺血时间越来越短,使得冷缺血再灌注损伤备受关注,许多研究表明:这一事件与移植物的功能发挥不良,急性排斥反应,移植物与受体的存活密切相关.为了更便捷肝脏缺血再灌注损伤基础研究,我们建立了一种小鼠肝脏原位冷缺血再灌注模型来模拟肝脏移植中缺血再灌注过程.结论:1.阻断肝下下腔静脉、肝动脉和门静脉能保持灌注后肝脏无肝期内的无血状态,2.成功建立小鼠肝脏原位冷缺血再灌注模型,该模型较好地反映了肝脏缺血再灌注损伤后血清酶学和组织病理学的动态变化.第二部分:尿胰蛋白酶抑制剂对小鼠肝脏冷缺血再灌注损伤的保护作用研究; 缺血再灌注损伤是指机体器官组织缺血再灌注恢复循环血流后,往往会造成器官功能不良,甚至发生更为严重的组织损伤或器官功能衰竭.肝脏缺血再灌注损伤是一种常见的病理生理过程,临床上的肝叶切除、以及广泛的肝外伤手术等,为了止血,需要临时阻断肝脏血流;严重的创伤、休克也常导致肝脏血循环的减少;肝脏移植时,肝脏血流也不可避免的临时中断等均可导致这一事件的发生.因此,力图减轻缺血再灌注损伤是提高肝移植术成功率和降低术后并发症发生的关键途径.虽然已有许多关于肝脏的缺血再灌注损伤的机理研究,但目前人们对其真正的分子机制了解尚未完全清楚.现众多研究发现,肝脏低温保存再灌注引起的细胞分子变化,是引起早期并发症的重要因素之一.肝脏缺血再灌注不仅可以引起肝细胞钙离子超载、氧自由基和细胞粘附分子的激活、细胞因子释放、一氧化氮和内皮素的变化Kupffer细胞的活化、与微循环功能不良,而且可直接导致肝细胞的损伤和凋亡. 尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)分子中存在多种酶的结合位点,能够同时独立抑制多种酶,包括胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶和纤溶酶等.目前,国内多用于胰腺炎、围手术期大脏器保护的治疗.近年来,国内外均有文献报道其在移植领域的作用,但UTI保护肝脏免受或减轻缺血再灌注损伤作用的机理尚未明确,还需进一步研究探讨. 材料与方法:选用8-12周龄25-30g健康雄性BALB/C小鼠作为实验动物,共分为四组:假手术组,对照组,预防组,治疗组.按第一部分介绍的方法建立模型.预防组在肝脏缺血前5min,小鼠尾静脉内注入UTI 50,000U/Kg;治疗组在无肝期结束后30min,小鼠尾静脉内注入UTI 50,000U/Kg.各组再灌注后1h、3h、6h、24h时点获取肝脏和血液标本.全自动生化分析仪测定血浆中ALT、AST水平;NF-κB和MPO Kit分别检测肝脏组织中NF-κB含量和MPO活力;TUNEL法检测肝细胞的凋亡情况;免疫组织化学、RT-PCR、Western bolt法检测组织中TNF-α、IκB-α、KC、MIP-2、P-selectin、E-selectin、ICAM-1及iNOS在各时点的蛋白和mRNA表达水平;光镜下观察形态学改变.统计学上采用Student's,Mann-Whitney,Chi-Square等检验方法.结果: 再灌注后各时点血ALT、AST水平均明显升高,术后6小时达高峰.与假手术组相比三组ALT、AST水平均明显增高(分别为317±7Ou/L;257±69 u/L;293±33u/L vs 80±4.2 u/L;P<0.05);预防组和治疗组6h、24h的ALT、AST水平明显低于对照组(P<0.05);预防组6h、24h的ALT水平和6h的AST水平均低于治疗组(分别为919±250u/L vs 1272±269 u/L;484±63 u/L vs 651±159 u/L;1050±265u/L vs1446±300 u/L;P<0.05).病理学检查示,再灌注后6h,对照组组织改变明显,预防组和治疗组的损伤较轻.TUNEL法检测发现,预防组再灌注后3h、6h、24h的细胞凋亡数均低于对照组(分别为12.0±7.3个/HP vs 22.3±9.6个/HP;20.5±12.5个/HP vs36.3±18.6个/HP;14.6±8.9个/HP vs 25.3±14.3个/HP;P<0.05);预防组再灌注后6h时点的细胞凋亡数低于治疗组(为20.5±12.5个/HP vs 32.0±15.4个/HP;P<0.05);肝脏细胞凋亡程度依次为对照组>治疗组>预防组,凋亡高峰发生在6h时点.免疫组织化学、RT-PCR、Western bolt法在不同水平检测上均提示TNF-α、KC、MIP-2、P-selectin、ICAM-1及iNOS在对照组中的表达强于预防组.IκB-α、E-selectin在各组中表达均有升高,但无统计学差异.NF-κB含量的检测结果显示,再灌注后1h、3h、6h肝脏组织中NF-κB水平逐渐增高,与假手术组差异有显著性;预防组1h、6h的NF-κB水平低于对照组(分别为0.017±0.O09 vs 0.039±0.013;0.067±0.018 vs 0.122±0.040;P<0.05);预防组1h的NF-κB水平低于治疗组(为0.017±0.009 vs 0.035±0.011;P<0.05).MPO的检测结果显示,再灌注后1h、3h、6h肝脏组织中MPO逐渐增高;预防组1h、6h、24h和治疗组6h点的MPO均低于对照组(分别为0.096±0.134u/g vs 0.213±0.349u/g;0.333±0.261u/g vs 0.797±0.400u/g;0.116±0.109u/gvs 0.345±0.222 u/g;0.399±0.269u/g vs 0.797±0.400 u/g;P<0.05).结论:1.TNF-α、NF-κB、KC、MIP-2、P-selectin、ICAM-1、iNOS在肝脏冷缺血再灌注损伤模型中高表达,为参与肝脏冷缺血再灌注损伤的主要分子机制.2.UTI能有效降低上述因子的表达,明显抑制中性粒细胞在肝脏组织中的聚集,在肝脏冷缺血再灌注损伤发生的多个环节发挥保护作用.3.术前预防性用UTI比术后治疗性用药更能发挥保护作用.
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