多角体/人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合基因在家蚕细胞和幼虫中表达的研究

摘要

该研究首先通过PCR将家蚕杆状病毒多角体蛋白起始密码子后的18个碱基引入到hGM-CSF基因的5'端之前,然后将融合基因重组与家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAK8-6aa-hGM-CSF,并与线性化Bm-BacPAK6DNA共转染家蚕细胞株,获得重组病毒BacPAK-6aa-hGM-CSF.PCR和Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有6aa-hGM-CSF基因.重组病毒以MOI=10感染家蚕细胞(2×10<'6>个细胞/5ml),以MOI=5接种家蚕5龄幼虫,结果发现:1、采用GM-CSF依赖细胞株TF-1和MTT比色法测定表达产物的生物活性,细胞内表达产物、家蚕幼虫和蚕蛹体液都具有较高活性,而阴性对照和空白对照无活性.说明了重组病毒在细胞内、家蚕幼虫和蚕蛹体内得到了成功表达,并且具有活性.2、通过对表达产物生物活性测定,细胞内表达量为31.98mg/L,蚕血淋巴表达量为210.9mg/L,蚕蛹内表达量为37.56mg/L.3、通过对表达产物ELISA检测和MTT比色法检测,发现两者在确定表达量方面存在很大差异,因此推测可能与蚕体内的糖基化有关.4、合前后表达产物的ELISA测定和生物活性测定比较,融合后产物在表达量增加10﹪情况下,生物活性并升高,推测可能与hGM-CSF的空间结构有关.

目录

文摘

致 谢

缩略语

第一部分文献综述与实验设计方案

第一章粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的研究进展

1 GM-CSF的发现

2 GM-CSF的结构与功能

3 GM-CSF的作用机理

4 GM-CSF的临床应用

5 GM-CSF的基因工程研究

第二章杆状病毒表达载体系统

1昆虫杆状病毒表达系统的基本原理

2转移载体

3重组病毒筛选方法的改进

4影响昆虫系统表达量的因素

5杆状病毒表达载体系统的特点

6杆状病毒表达载体系统的应用展望

第三章实验设计

1本实验的目的和意义

2本研究的主要内容

3本研究要解决的关键性问题

4实验流程图

第二部分研究内容

第四章家蚕杆状病毒重组转移载体的构建

1材料和试剂

2实验方法

3结果与分析

4讨论

第五章重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定

1材料和试剂

2实验方法

3结果与讨论

1材料和试剂

2实验方法

3结果与分析

4讨论

结 论

参考文献

附 录