v-Src蛋白酪氨酸激酶的表达优化及活性的初步研究

摘要

Src蛋白是一种分子量约60KDa的非受体酪氨酸蛋白激酶.其主要以两种形式存在:病毒癌基因表达蛋白v-Src和细胞癌基因表达蛋白c-Src.c-Src蛋白的表达和活性异常是某些肿瘤发生、发展的原因之一;v-Src蛋白本身就能诱导细胞的转化和肿瘤的发生.它们在胞内信号转导途径中都起着重要的作用.以往的研究大都集中在c-Src蛋白的结构、调控和功能等方面,而对v-src基因的克隆表达及其蛋白产物的相关研究比较少.该文通过构建pGEX-KT/v-src重组质粒,表达纯化出大量有激酶活性的GST-Src蛋白,并对其进行初步的性质分析,着重进行了如下几部分的研究:第一部分:通过研究菌株、细菌诱导前的生长期温度和密度、培养基、诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间对大肠杆菌GST-Src蛋白表达的影响,确定v-src基因表达的最佳条件,并对表达产物的纯度和表达量进行初步的分析.第二部分:确立细胞提取物和包涵体制备的最佳条件,即菌体超声破碎120次,每次2s,间隔时间4s;包涵体洗涤温度为4℃,尿素洗涤液的浓度为2M,洗涤时间8h;8M尿素的裂解缓冲液对包涵体进行溶解,蛋白质浓度为0.181 mg/ml.第三部分:确定分离纯化的最佳条件,即4℃过夜洗脱,收集第2-4ml的洗脱组分.第四部分:采用辣根过氧化物酶标记的酪氨酸磷酸化单抗(HRP-PY20)的免疫吸附,检测掺入到poly Glu:Try(4:1)中的磷酸根含量,来分析优化条件下生产的可溶性GST-Src蛋白及其包涵体溶液的酪氨酸激酶比活力.结果表明,洗脱组分中GST-Src蛋白的平均激酶比活力约为0.38 nmol/min/mg,包涵体的激酶比活力约为1.13 nmol/min/mg.

目录

文摘

英文文摘

第一章Src蛋白国内外研究进展

引言

1 Src蛋白的结构

1.1基因组成

1.2氨基酸组成

1.3结构域组成

1.4空间结构

2 Src蛋白的调控

2.1 c-Src蛋白的转录调控

2.2 c-Src蛋白的翻译后调控

3 Src蛋白的功能

3.1细胞的粘着和运动

3.2细胞的分裂增殖

3.3细胞存活

3.4血管收缩

3.5胞内运输

4 Src蛋白信号转导途径

4.1 Src蛋白与生长因子信号转导

4.2 Src蛋白与细胞因子信号转导

4.3 Src蛋白与整合蛋白受体信号转导

4.4 Src蛋白与G蛋白信号转导

4.5其他

5 Src蛋白与肿瘤的相关性

6 Src蛋白抑制剂

结束语

参考文献

第二章v-src基因的克隆与融合表达

1概述

2实验方法和结果

2.1 PCR引物设计及T-A克隆

2.2 pGEX-KT/v-src表达质粒的构建

2.3 GST-Src蛋白的诱导表达

2.4 GST-Src蛋白的纯化

3本章小结

参考文献

第三章GST-Src融合蛋白的表达优化

1概述

2实验材料和仪器

2.1感受态细胞和菌株

2.2质粒

2.3酶

2.4分子量标准

2.5试剂盒

2.6常用缓冲液和贮存液

2.7培养基

2.8化学试剂

2.9仪器设备

3实验方法

3.1 pGEX-KT/v-src表达质粒的抽提

3.2酶切检测与琼脂糖凝胶电泳

3.3大肠杆菌转化

3.4 GST-Src蛋白的诱导表达

3.5 GST-Src蛋白的纯化

3.6 GST-Src蛋白包涵体的抽提

3.7蛋白浓度的测定

4实验结果

4.1酶切检测质粒pGEX-KT/v-src

4.2 GST-Src蛋白的诱导表达

4.3 GST-Src蛋白的纯化

4.4 GST-Src蛋白包涵体的抽提

4.5蛋白浓度的测定

5本章小结

参考文献

第四章Src蛋白酪氨酸激酶活性的研究

1概述

2实验材料和仪器

2.1试剂盒

2.2缓冲液和贮存液

2.3化学试剂

2.4仪器设备

3实验方法

3.1磷酸肽标准曲线的制备

3.2酪氨酸激酶活性分析

4实验结果

4.1最适反应时间的确定

4.2酪氨酸激酶活性分析

5本章小结

参考文献

第五章应用前景及后续工作的建议

1应用前景

2后续工作建议

致谢