霍乱毒素B亚基乙肝表面抗原中蛋白融合基因在家蚕核型多角体病毒载体系统中的表达研究

摘要

现有的乙肝基因工程疫苗(含S抗原)接种后,约10%接种者为免疫无应答者,而使用增加了PreS2抗原的中蛋白疫苗(含S和PreS2抗原)可减少免疫无应答者的出现.霍乱毒素B亚基(CTB)具有很强的免疫原性,能刺激机体产生粘膜IgA和血清IgG抗体.它在免疫佐剂、口服疫苗与多肽疫苗的研究中具有越来越重要的作用.为了获得能够口服吸收的并能引起免疫应答的融合蛋白,该研究利用基因工程方法,将霍乱毒素B亚基乙肝中蛋白融合基因在家蚕杆状病毒载体表达系统中进行了表达.首先将霍乱毒素B亚基与乙肝中蛋白基因的重组到转移载体pBacPAK8,获得含有霍乱毒素B亚基与乙肝中蛋白融合基因的重组转移载体pBacPAK-CTB-HBM,并与已线性化的病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞,筛选出重组病毒BacPAK-CTB-HBM.将重组病毒BacPAK-CTB-HBM以10pfu/细胞感染家蚕家蚕培养细胞和幼虫,Western印迹方法表明表达产物大小约为43kD.用ELISA法测定表达产物的抗原性,结果显示:家蚕培养细胞的胞内表达产物具有明显的抗原反应性,重组病毒BacPAK-CTB-HBM感染的家蚕培养细胞第48 h的表达量最高,量约1.61ug/mL;BacPAK-CTB-HBM感染的家蚕蛹血淋巴也具有明显的抗原反应性,第120h的表达量最高,量约15.27ug/mL.将表达产物免疫动物后,用ELISA法测定表达产物的免疫原性,结果显示:在口服初免方式中,连续摄入六周后,停止摄入后四周开始检测抗体.融合蛋白组有60%的鼠体内产生了抗-HBs抗体,中蛋白组20%的鼠体内产生了抗-HBs抗体.在抗-HBs抗体阳转的鼠体内也检测到了相应的抗-PreS2抗体.口服加强免疫:在商用疫苗初免后抗体水平下降到P/N值低于5.0时连续摄入表达产物四周后检测抗体.融合蛋白组和中蛋白组全部检测到抗-HBs抗体,抗体水平逐渐增强,而且抗体水平持续维持在较高水平.

目录

致谢

缩略语

第一部分文献综述与实验设计方案

第一章乙肝病毒表面抗原及其基因工程疫苗的研究进展

1.1 HBsAg基因结构

1.2 HBsAg的功能

1.3 HBV感染的机理及乙肝疫苗的重要性

1.4乙肝疫苗的现状

1.5口服乙肝疫苗的研究进展

1.6利用昆虫杆状病毒表达载体系统生产乙肝疫苗的研究

1.7基因工程乙肝疫苗的发展方向

第二章霍乱毒素B亚单位的研究进展

2.1霍乱弧菌(V.cholerae)和霍乱毒素

2.2霍乱毒素B亚单位的基因表达

2.3霍乱毒素B亚单位的应用

2.4霍乱毒素B亚单位的研究进展

第三章杆状病毒表达载体系统

3.1昆虫杆状病毒表达系统的基本原理

3.2转移载体

3.3重组病毒筛选方法的改进

3.4影响昆虫系统表达量的因素分析

3.5杆状病毒表达载体系统的特点分析

第四章实验设计方案

4.1本实验的目的和意义

4.2本研究的主要内容

4.3技术路线

第二部分研究内容

第五章家蚕杆状病毒重组转移载体的构建

5.1材料和试剂

5.2实验方法

5.3结果

5.4讨论

第六章重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定

6.1材料和试剂

6.2试验方法

6.3结果

第七章霍乱毒素B亚基与乙肝中蛋白融合蛋白在家蚕细胞、幼虫和蛹中的表达及活性分析

7.1材料和试剂

7.2实验方法

7.3结果

7.4讨论

结论

参考文献

附图