多环芳烃菲对微生物生态毒理研究、菲降解菌的分离鉴定及降解基因克隆与表达

摘要

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs)在环境中分布广泛,极易在环境中累积并可通过食物链传递,对人类健康和生态环境具有很大危害性.菲因具有独特的化学结构,成为PAHs研究中的模式化合物,菲污染的研究不仅有利于污染环境中菲的去除,还可为其它PAHs污染的防治提供有价值的资料.该文全面探讨了菲污染对淹水稻田土壤的微生物生态毒性效应并分离到两株菲降解细菌,对其进行了鉴定以及系统发育研究,同时进行了降解特性和降解基因克隆及表达方面的研究,为建立有效的菲污染预警指标体系和菲降解微生物的有效利用提供有益的参考.该研究所获主要结论如下:1、以杭州临平镇附近农田水稻土为材料,采用室内培养方法系统研究了不同程度的菲污染对淹水稻田土壤可培养微生物种群以及酶活性动态变化过程的影响.2、从石油污染土壤中筛选分离到2株菲降解菌株,分别命名为ZX4和EVA17菌株.通过细菌形态学观察,生理生化测试,碳源利用实验(Biolog),G+Cmol%含量分析,全细胞脂肪酸分析以及16SrDNA和ITS序列同源性分析,证明两株菲降解细菌应属于鞘氨醇单胞菌属细菌.3、2株菲降解菌都具有良好的pH和菲含量适应性,菌株ZX4可以转化吲哚产生靛蓝.底物试验结果和降解酶(水杨酸羟化酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶)活性的测定表明,2菌株可能都是通过水杨酸途径来降解菲.该文结果也显示GST酶与多环芳烃的降解有关,并且2菌株的GST酶都具有与CDNB结合的活性.4、根据已知序列设计引物在菌株EVA17中扩增得到芳香环羟化双加氧酶铁硫蛋白α亚基编码基因,该基因全长1368bp,编码455个氨基酸.蛋白质三维结构显示其具有Rieske-型[2Fe-2S]中心和单核铁原子结合域这两个在酶的催化功能上具有重要作用的保守结构.并且其氨基酸序列与来自Sphingomonas sp.P2的铁硫蛋白α亚基同源性最高.5、通过对降解菌株ZX4降解基因的克隆转化以及序列分析,得到间位裂解操纵子的部分基因及其邻近基因,并探知它们基因排列顺序依次为编码谷胱甘肽转移酶基因、编码2-羟粘糠酸半醛水解酶基因以及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.6、根据已知序列设计引物,自菌株EVAl7中克隆得到谷胱甘肽S-转移酶基因,该基因片段全长606bp,编码201个氨基酸残基,基因核酸序列与Sphingomonas sp.P2和Sphingomonas paucimobilis EPA505的GST编码基因序列同源性最高.7、设计GST编码基因保守区引物在PAHs降解菌株和PAHs污染土壤中的成功扩增,说明该实验设计的引物可用于PAHs降解菌株和PAHs污染土壤的检测.GST基因和C23O基因的共扩增结果说明EVA17中GST基因位于C23O基因的上游.8、对分离菌株进行了基于16S rDNA、ITS序列以及降解基因系统发育的比较,结果表明,分离菌株都与鞘氨醇单胞菌属细菌聚为一群.但基于降解基因系统发育与16S rDNA序列比较也存在一些差别.

目录

文摘

致谢

第一章前言

第一节多环芳烃菲的微生物降解综述

1.多环芳烃的累积和环境毒性

2.菲的生物降解

3.菲污染的生物修复

第二节细菌谷胱甘肽S-转移酶结构功能及其在芳烃降解中的作用

1.GST的分类及蛋白结构

2.细菌中GST的催化类型

3.GST在异生物质降解中的作用

4.GST基因的进化路程

5.GST酶的应用潜力

第二章菲对水田微生态系统的急性效应

1.材料与方法

2.结果

2.1菲对土壤好氧细菌数量动态变化影响

2.2菲对土壤中真菌数量动态变化的影响

2.3菲对土壤放线菌数量的动态影响

2.4菲对土壤水解发酵性细菌数量的动态影响

2.5菲对土壤厌氧固氮菌数量动态变化的影响

2.6菲对土壤产甲烷细菌数量动态变化的影响

2.7菲对土壤脱氢酶的动态影响

2.8菲对土壤脲酶活性的动态影响

2.9菲对稻田土壤微生物(真细菌)群落结构的DGGE分析

3.讨论

3.1菲对土壤好氧微生物种群的影响

3.2菲对土壤厌氧微生物种群的影响：

3.3菲对土壤酶活性的影响

3.4菲对土壤微生物(真细菌)多样性的影响

第三章菲降解菌株分离、鉴定及系统发育研究

1.材料与方法

2.结果

2.1分离菌株的降解能力

2.2分离菌株的形态学研究

2.3分离菌株的生理生化特性

2.4分离菌株的抗生素敏感性

2.5分离菌株的全细胞脂肪酸分析

2.6 G+C mol％含量分析

2.7分离菌株碳源利用

2.8分离菌株的16S rDNA序列分析

2.9分离菌株的ITS序列分析

2.10基于16S rDNA序列系统发育树的构建

2.11基于分离菌株和同属细菌ITS序列的系统发育树

2.12遗传距离矩阵建立

3.讨论

第四章菲降解菌株生长和降解特性研究

1.材料与方法

2.结果

2.1菲降解菌株生长条件

2.2降解菌株菲降解途径的初步探讨

2.3菌株ZX4的菲降解特性

3.讨论

第五章菲降解菌芳香环羟化双加氧酶铁硫蛋白α亚基基因的克隆

1.材料与方法

2.结果

2.1引物1扩增和测序结果

2 2引物2在菌株EVA17中的扩增结果

2.3阳性克隆子的筛选与鉴定

2.4目的基因的序列测定与分析

2.5系统发育构建

3.讨论

第六章菲降解菌间位裂解操纵子基因克隆

1.材料与方法

2.结果

2.1基因克隆

2.2核酸序列测定与分析

2.3 phnH基因编码氨基酸序列推导与分析

2.4基于MCP水解酶基因序列系统发育树构建

2.5 phnI基因编码氨基酸序列推导与分析

2.6基于邻苯二酚2，3-双加氧酶基因序列系统发育树构建

3.讨论

第七章邻苯二酚2，3-双加氧酶编码基因在大肠杆菌中的表达

1.材料与方法

2.结果

2.1邻苯二酚2，3-双加氧酶编码基因的PCR扩增及表达载体的构建

2.2重组表达载体的酶切鉴定结果

2.3外源基因在大肠杆菌中的表达与酶活分析

2.4重组菌株邻苯二酚2，3-双加氧酶活性的检测

3.讨论

第八章谷胱甘肽S-转移酶编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

1.材料和方法

2.结果

2.1 GST编码基因的PCR扩增及序列测定

2.2 GST氨基酸序列同源性分析

2.3表达载体的构建

2.4 GST基因在大肠杆菌中的诱导表达

2.5 Western Blottingtest

2.6重组菌株GST活性的检测

3.讨论

第九章GST编码基因克隆引物的应用

1.材料和方法

2.结果

2.1降解菌株GST酶编码基因的PCR扩增

2.2基于GST编码基因保守区的系统发育树构建

2.3 GST与C23O共扩增及序列测定

2.4 GST编码基因的引物在污染土壤DNA中的扩增

3.讨论

Abstract

本文主要结论及展望

参考文献

博士研究生学习期间论文及获奖情况