非离子表面活性剂在胶体基因给药系统中的应用

摘要

基因治疗自1989年首次进入临床试验，至今已有十六年。经历了多年的发展，基因治疗的应用也从遗传性病症的治疗，扩展到获得性疾病的防治，并被视为新千年的医疗革命。迄今，已有近1,000例基因治疗被批准进入临床试验。其间由于病毒载体的安全性问题而引致的治疗意外事故，使人们逐渐认识到基因给药系统的有效性和安全性是基因治疗临床应用的技术瓶颈。以阳离子脂质体、阳离子聚合物纳米粒为代表的非病毒载体，由于其安全性能、易于大规模制备等的优越性，在基因治疗应用中备受瞩目。非病毒类载体存在的主要问题是转染效率显著低于病毒类载体，尽管人们也进行不断的研究，运用各种手段加以改造，也取得的一定的成就，但其较低的基因传递效率，成为阳离子脂质载体的临床成功应用的限制因素。 本课题将非离子表面活性剂应用于阳离子脂质胶体给药系统，研究了非离子表面活性剂作为修饰剂对阳离子脂质体的影响，以及采用非离子表面活性剂为主要组分构建了囊泡基因给药系统。通过本课题研究，构建了新的基因给药系统，为研究开发高效安全的基因非病毒类载体的提供新思路。 本实验应用失水山梨醇脂肪酸酯系列-司盘表面活性剂对阳离子脂质体进行修饰，构建了阳离子胶体基因给药系统。考察了司盘的不同种类，不同浓度修饰的效果。采用了透射电镜、粒度分析、zeta电位测定、浊度等方法对此司盘修饰阳离子脂质体进行了物理表征；以反义寡核苷酸为模型，制备反义寡核苷酸/司盘修饰阳离子脂质体复合物。本实验建立荧光分析方法，对反义寡核苷酸/司盘修饰阳离子脂质体复合物的结合方式进行研究。根据荧光探针产生荧光强度差异程度，来证实OND有存在于脂质体内部，依此并可推测被包裹OND的数量。进一步以体外培养细胞(COS7，Hela&RKO细胞系)摄取实验，评价其作为基因药物载体的传递效率，并对司盘的种类、浓度、血清浓度、粒径等影响因素，以及介导入胞的机制进行了考察，还研究了司盘HLB值与细胞摄取效率的关系。 实验结果表明，司盘的摩尔浓度应控制小于16.7mol.﹪，否则对脂质体结构会造成破坏作用。此浓度以下的司盘修饰，脂质体仍保持良好的物理稳定性，在实验考察期内，粒径未见显著改变。本实验制备所得司盘修饰阳离子脂质体粒径均在100～200nm之间，zeta电位在+30～+45mV之间。OND与司盘修饰阳离子脂质体的+/-电荷比例为4时，两者可完全结合，凝胶电泳可完全被阻滞。OND在阳离子脂质体内外分布研究表明，OND较大部分是以静电吸附形式结合在脂质体表面，而部分OND则可以进入脂质体内部。 司盘修饰阳离子脂质体介导OND，具有较高的体外细胞摄取效率。比较不同司盘(HLB值为1.8～8.6)修饰的效果，发现司盘40(HLB值为6.7)效果最好，而混合应用司盘80与20(混合HLB值为6.45)的效果与司盘40相当；与未用司盘修饰的阳离子脂质体相比，均有显著的提高。这提示用HLB6～7的司盘表面活性剂修饰，可获得较高的细胞摄取效率。具有适当HLB值的表面活性剂，可能通过调节基因微粒载体的表面特性，有利于其内吞进入细胞。在本实验选用的多种内吞抑制剂(氯喹、N-乙基顺丁烯二酰亚胺、叠氮钠)存在条件下，司盘修饰的阳离子脂质体介导细胞摄取的能力显著下降。另外在4℃细胞培养环境里进行细胞摄取实验，也得到相似的结果。这是由于在低温条件下能量代谢受抑制，而内吞是能量依赖的过程。这均证实内吞是反义寡核苷酸/司盘修饰阳离子脂质体复合物主要的入胞途径。 本实验制备了不同粒径的阳离子脂质体(123.8、221.1、420.9和644.1nm)，考察粒径对细胞摄取效率的影响。在一定范围内摄取效率与粒径大小存在着依赖性的关系。粒径越小，介导摄取的效率越高。内吞入胞途径中，由于内吞体(endosomes)平均直径在100～200nm，所以太大的微粒，细胞难以产生内吞作用对其进行摄取，减小粒径可更加有效地提高细胞摄取效率。 血浆中很多成分(如血清蛋白)可以与阳离子脂质体发生非特异性的相互作用，血清蛋白对阳离子脂质体/基因药物复合物表面的阳电荷产生屏蔽作用，会大大降低了阳离子脂质体的转染能力。司盘40修饰阳离子脂质体，在10﹪血清培养基中，仍可保持较高的细胞摄取效率，说明表面活性剂可在一定程度上阻止血清蛋白与载体的结合。但在高浓度血清条件下，司盘修饰阳离子脂质体介导细胞摄取的效率均下降至极低的水平。 非离子表面活性剂囊泡(non-ionicsurfactantsvesicles)，是以非离子表面活性剂为膜材，可在水相中自发组装形成的，具有双分子层膜的封闭状囊泡。其组分一般包括有非离子表面活性剂和胆固醇。本实验用非离子表面活性剂司盘、吐温、普流朗克，以及阳离子胆固醇衍生物-3β[N-(N'，N'-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇，制备得到阳离子囊泡，并用作基因载体。 制备阳离子囊泡，粒径均在200nm以下，形态圆整。Zeta电位在+30～+50mV之间，说明阳离子胆固醇使囊泡带净正电荷。通过凝胶电泳实验考察阳离子囊泡与反义核酸的结合能力，当+/-比为4时，反义核酸可全部被结合，形成复合物。细胞摄取和转染实验表明，司盘和吐温非离子表面活性剂囊泡介导细胞摄取，均有较高的基因传递效率；介导编码绿色荧光蛋白质粒DNA的转染，也有较好的表达效率。表明阳离子囊泡是一种颇具潜力的基因给药系统。 季铵盐阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)具有与DNA较强的结合能力。CTAB能够压缩折叠DNA分子，形成微粒；CTAB还具有DNA从溶酶体释放进入胞浆的作用。利用CTAB的阳离子性质以及溶酶体逃逸作用，制备并评价了含CTAB囊泡基因载体。CTAB具有较强的细胞毒性作用，作为囊泡组成部分的CTAB，相较于游离CTAB，细胞毒性大大降低。应用于细胞转染，含CTAB囊泡具有较高的转染效率，与商品化试剂DOPE/DC-Chol脂质体相当。 立体稳定微粒给药系统(StericallyStabilizedmicropaticlesdrugdeliverysystems)是药剂学研究的热点。聚乙二醇(poly(ethyleneglycol)，PEG)修饰技术，已非常成熟地应用于立体稳定微粒的制备。本实验参考立体稳定脂质体的制备方法，成功地在非离子表面活性剂囊泡中应用PEG修饰技术，制备得到立体稳定囊泡。 以浊度变化为指标，考察立体稳定阳离子囊泡在含10﹪血清PBS中的稳定性。在6h内，其吸光度基本保持不变，说明囊泡表面亲水层的作用，可阻止阳离子载体与血清蛋白结合，以及囊泡之间的相互融合。比较阳离子囊泡、立体稳定阳离子囊泡与牛血清白蛋白结合率，前者与蛋白的结合显著高于后者，进一步表明了，PEG在囊泡表面形成立体保护层。酶降解实验表明，亲水性材料PEG在阳离子囊泡表面形成立体构象层，可有效地保护DNA抵抗酶的降解，并能使阳离子囊泡在血清中较长时间的稳定存在。 本实验用“前包被法”和“后包被法”两种方法制备DNA/立体稳定囊泡复合物，比较了两者在含血清培养基中介导反义寡核苷酸的效率。两种方法制备所得的DNA/立体稳定囊泡复合物，均具有较好的基因传递效率，并显著高于普通阳离子囊泡。不同的制备方法得到不同结构的复合物，对基因药物的保护作用和细胞摄取有着不同的影响。“后包被法”具有更优越的基因传递性能。 本课题用司盘等非离子表面活性剂修饰阳离子脂质体，并构建非离子表面活性剂囊泡作为基因载体，显著提高了基因传递效率。这些尝试可为基因给药系统的研究提供新的思路与方法。本课题发现修饰脂质体的司盘的HLB值对细胞摄取有一定影响，其最优HLB值为6～7。利用阳离子脂质体的跨膜pH梯度，建立了荧光技术研究OND在阳离子脂质体内外分布的新方法。实验首次在非离子表面活性剂囊泡的制备中引入阳离子胆固醇，成功制备得到多种新型阳离子囊泡；进一步构建了立体稳定阳离子囊泡基因载体。这些研究结果将有助于高效、安全的胶体基因给药系统的研究开发。

目录

论文说明：Abbreviation

摘要

前言

第一章司盘修饰阳离子脂质体的制备及表征

第二章司盘修饰阳离子脂质体的体外细胞摄取及转染研究

1.材料与仪器

2.实验方法

3.结果与讨论

4.小结

第三章非离子表面活性剂囊泡的研究－司盘阳离子囊泡

1.材料与仪器

2.实验方法

3.结果与讨论

4.小结

第四章其他非离子表面活性剂囊泡的研究

1.材料与仪器

2.实验方法

3.结果与讨论

3.1吐温阳离子囊泡

3.2Tween85/PluronicF108阳离子囊泡

3.3Span40/CTAB/Cholesterol囊泡和Tween85/CTAB/Cholesterol囊泡

4.小结

第五章立体稳定阳离子囊泡(Sterically Stabilized Cationic Niosomes)的研究

总结

论文创新点

Reference List

综述1 基因给药系统的核靶向研究

综述2　DNA/阳离子脂质体复合物的构效研究

论文情况

Acknowledgments