哺乳细胞暴露于化学致癌剂MNNG的候选生物标记物的筛选和鉴定

摘要

烷化剂尤其是N-亚硝基类烷化剂广泛存在于环境中，引起DNA烷基化。其中单功能烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是最常用于研究N-亚硝基类烷化剂的模式化学诱变剂和致癌剂，它能和DNA及蛋白质等生物大分子形成加合物(adduct)，这些加合物最终可导致染色体异常，点突变和细胞死亡。其引起的与突变有关的主要DNA损伤类型是06-甲基鸟嘌呤，这种损伤与肿瘤尤其是胃癌的发生密切相关。 我们实验室曾用一特殊的突变检测系统，直接证明DNA损伤剂可在哺乳动物细胞诱发非定标性突变：首先用低浓度(0.2μM)的短寿烷化剂MNNG(半寿期为1.1h)处理细胞2.5h后，继续培养24h，将重组有用作突变检测的靶基因supFtRNA基因的穿梭质粒pZ189转入细胞复制，发现在未受致癌物直接攻击的穿梭质粒中有较自发突变率高5倍以上的靶基因突变。这种突变并非在接受MNNG攻击以后立刻出现，而是具有时相依存性，在致癌物攻击后其发生率逐渐升高，在12h达最高峰，以后逐渐下降。且突变谱明显不同于由MNNG直接攻击引起的定标性突变，有其突变好发部位的序列特异性。 进一步地，我们还证明了低浓度MNNG的作用下有广泛的细胞反应，尤其是在信号转导通路的激活和基因表达的改变的研究中取得了一些突破性的进展。例如细胞表面受体如表皮生长因子受体、肿瘤坏死因子受体发生聚簇，内质网应激反应和细胞信号转导通路cAMP-PKA-CREB和JNK/SAPK的激活。更值得注意的是这些有关信号转导通路的激活并不依赖于细胞核中的DNA损伤，因为在除细胞核的细胞中这些信号通路的激活仍可被诱发。我们还利用mRNA差异显示技术分离到了近30个在MNNG处理后表达改变的表达序列标签(expressedsequencetag，EST)。其中9号片段在MNNG处理后表达增高，其表达改变不受蛋白质合成抑制剂的影响。利用反义核酸技术构建含反向插入9号片段的真核细胞表达重组体并转染细胞，以获得反义RNA阻断vero细胞中相应基因的表达，发现MNNG诱发的非定标性突变频率显著增高，提示被阻断的相关基因的表达产物可能参与抑制非定标性突变的发生。 生物标记物对于疾病的筛查、诊断、分期、预后、疗效判断以及监测疾病复发是十分必要的。目前，高通量、自动化芯片技术的迅速发展，使生物标记物的鉴定在技术上有了重大的突破。但高通量基因组学技术只能在mRNA水平上反映基因表达的改变，并不能揭示所有与疾病相关的蛋白质。已有很多资料表明细胞内mRNA的表达水平同活性蛋白质的量之间并不是简单的线性关系，从mRNA的转录到蛋白质的合成并执行功能受多个水平调控，包括转录后水平的调控及翻译后调控。另外，基因组学技术也不能检测蛋白质之间是否发生相互作用、这些作用是怎样发生的，及在不同的条件下蛋白质的定位是否发生变化。因此从蛋白质入手，通过一定的方法识别、分离和鉴定与疾病发生相关的差异表达蛋白质，寻找疾病不同进展阶段的关键蛋白，有助于更深入地阐明疾病发生的机理，并为寻找与早期诊断、治疗和评估预后相关的标记物提供线索。 蛋白质组学(Proteomics)是后基因组时代生命科学研究的热点领域。它是以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。目前蛋白质组学技术已被广泛的应用到生物标记物的研究中。因此，我们实验室用蛋白质组学的方法研究低浓度烷化剂MNNG诱发的细胞应答反应。在这些差异表达的蛋白点中有36个蛋白点用基质辅助激光解吸—飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)方法得到鉴定。这些鉴定的蛋白可以作为评价MNNG暴露的候选标记物。然而，用于监测人群暴露于致癌剂的最好的标本是体液，可以通过非创伤性手段获取，经济方便。因此，最好的评价致癌剂暴露的生物标记物应该是存在于体液中的从细胞中分泌或外漏的蛋白或从膜蛋白上脱落的肽段。体液如血液，尿液，胃液和唾液比组织更容易通过非创伤手段获取，寻找体液中的候选生物标记物，可以方便的监测人群是否暴露于有害环境。另外，因为血液等体液中成分复杂，而体液中的标记物往往是低丰度的，用一般蛋白质组学方法较难检测。因此我们先确定细胞培养上清中的候选标记物，再进一步用免疫学方法检测该标记物在血液等标本中的分布。 综上所述，为寻找便于检测的生物标记物并进一步阐明MNNG致突变的机制，我们收集了暴露于低浓度烷化剂MNNG的细胞培养上清(在一定程度上可以模拟体液)，蛋白经超滤浓缩、冷丙酮沉淀和Bradford法定量后采用24cm，pH3-10的IPG胶条进行第一向等电聚焦，12.5％的SDS-PAGE进行第二向电泳分离，电泳后的凝胶用银染进行染色，并用Phoretix2D6.01软件对电泳结果进行数据采集和图像分析，建立烷化剂MNNG暴露组和对照组的细胞外蛋白质差异表达图谱。我们发现在MNNG处理后，与对照组相比，培养上清中出现的点有12个，表达上调的蛋白质点有4个(P＜0.05)。 在此基础上，我们切取差异表达的蛋白质斑点，然后用特异性的胰酶消化蛋白质，酶解后的肽段采用Voyager-DESTRMALDI-TOF(ABI)质谱仪进行质谱分析。利用质谱分析得到的原始数据，通过MSCOT搜索NCBInr的蛋白质序列数据库，在16个差异表达的蛋白质点中，13个蛋白点通过质谱分析和数据库的检索得到了初步的鉴定。这些鉴定的蛋白质包括核型dUTP焦磷酸酶(DUT-N)、磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、焦磷酸法呢酯合成酶(FPPS)、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)等。 另一方面，我们用双向凝胶电泳方法分析低浓度MNNG处理后细胞裂解总蛋白的差异蛋白图谱，其中471蛋白点在MNNG处理后下调(P＜0.05)，质谱鉴定该蛋白为核型dUTP焦磷酸酶。因此，核型dUTP焦磷酸酶特别引起了我们的注意。为进一步验证双向凝胶电泳和质谱鉴定结果的准确性，我们采用Westernblot方法证明了MNNG处理后DUT-N在细胞外液的出现以及它在细胞内的表达下调。 通过对以上结果进行分析，我们得出如下结论：运用双向凝胶电泳结合质谱分析的方法可以有效分离鉴定暴露于MNNG后细胞外液差异表达的蛋白质，方法简单，结果可信。筛选到的16个差异表达的蛋白质尤其是核型dUTP焦磷酸酶可以作为监测人群接触环境致癌物MNNG后有效的早期生物标记物，并进一步阐明了MNNG致癌致畸的机制。

目录

缩略语

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

综述:肿瘤坏死因子α转换酶结构和生物学功能简介

附录

致谢