阿司匹林对外周血内皮祖细胞数量与功能及其iNOS的影响

摘要

目的：血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是血管内皮的前体细胞，这些内皮祖细胞来自于骨髓中的前体细胞。新近研究表明，血管内皮祖细胞不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓及外周血，在成体血管新生中起重要作用。近年来的研究表明EPCs在冠心病的发生、发展中扮演了重要角色，血管内皮祖细胞数量减少预示血管内皮修复能力降低，心血管疾病发生率增高。阿司匹林(aspirin)广泛用于心血管疾病的防治，为重要的非甾体抗炎药，主要通过抑制环氧化酶而抑制花生四烯酸的代谢，减少前列腺素的合成，抑制炎症、抑制血小板聚集。大量临床研究证实，阿司匹林可减少与动脉粥样硬化有关疾病的发生。一氧化氮(NO)由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)合成，是细胞中重要的信号分子。本文旨在研究阿司匹林对内皮祖细胞的数量及增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力的影响，并探讨阿司匹林对内皮祖细胞中iNOS的影响。 方法：实验血液样本来自6位健康志愿者，每份血液完成一组实验，包括对照组和药物干预组的EPCs数量及功能检测。采用密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上。M199培养基培养4d，用PBS洗掉非贴壁细胞，换培养液继续培养至7d，用PBS洗掉非贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。贴壁细胞随机分成15组，每组6孔，1-5组为对照组，为正常培养组，分别培养0、3、6、12、24h；6-10组分别加入含阿司匹林0、1、2、5、10mmol/L的无血清培养基培养24h；11-15组为阿司匹林5mmol/L组分别培养0、3、6、12、24h。激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs，将其在倒置荧光显微镜下计数。然后分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管形成试剂盒来观察EPCs的增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力，免疫印迹杂交法(Westernblot)半定量测定iNOS含量。 结果：1.EPCs的鉴定分离获得的单个核细胞培养7d后形成了梭形的内皮样细胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-Ⅰ对细胞染色后，通过激光共聚焦显微镜鉴定，FITC-UEA-Ⅰ和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs，在倒置荧光显微镜下(×200)计数15个随机选择视野的EPCs。 2.阿司匹林对外周血EPCs数量的影响不同浓度的阿司匹林与EPCs培养24h显示阿司匹林能减少EPCs数量，并且EPCs数量随阿司匹林浓度增加而降低；在5mmol/L组中亦可见EPCs数量随阿司匹林作用时间增加而降低。 3.阿司匹林对外周血EPCs增殖功能的影响采用MTT比色法检测阿司匹林对EPCs增殖能力的影响，结果显示：阿司匹林显著降低EPCs的增殖能力，呈一定的量效关系。在5mmol/L阿司匹林组中呈时间依赖性降低EPCs的增殖能力。 4.阿司匹林对外周血EPCs迁移功能的影响采用改良的Boyden小室检测阿司匹林对EPCs迁移能力的影响，在200倍显微镜下计数迁移的细胞。阿司匹林明显降低了EPCs的迁移能力，且EPCs的迁移能力下降呈作用浓度和时间依赖性。 5.阿司匹林对外周血EPCs黏附功能的影响为了观察阿司匹林对外周血EPCs黏附能力的影响，先将不同浓度的阿司匹林与EPCs培养24h，然后将相同数量的EPCs重新接种到包被有人纤维连接蛋白的培养板上培养30min，结果显示阿司匹林明显降低了EPCs的黏附能力，且EPCs的黏附能力下降呈阿司匹林作用浓度和时间依赖性。 6.阿司匹林对外周血EPCs体外血管形成能力的影响体外血管形成实验结果显示，阿司匹林明显抑制EPCs的体外血管形成能力，其抑制作用呈浓度依赖性。 7.阿司匹林对外周血EPCs中iNOS表达的影响采用免疫印迹杂交法获得iNOS条带，显色后用凝胶成像系统扫描，半定量分析显影条带。阿司匹林降低了EPCs的iNOS，且EPCs的iNOS下降呈阿司匹林浓度和时间依赖性。 结论：1.可以从外周血中的单个核细胞分离和培养血管内皮祖细胞。 2.阿司匹林减少外周血EPCs数量，降低EPCs的增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力，其抑制效应呈浓度和时间依赖性。 3.阿司匹林还减少EPCs中iNOS含量。

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

成人血管内皮祖细胞与血管新生

博士在读期间发表及录用的论文

致谢