氯化高铁血红素对血管内皮细胞磷酸化Erk1/2的诱导作用及其相关机制

摘要

目的:正常人体红细胞中含有血红蛋白，当红细胞被代谢破坏后释放血红蛋白，血红蛋白继而被氧化释放出血红素(heme)分子。heme可以直接进入血管内皮细胞膜，使得细胞膜更易发生氧化损伤最终导致内皮细胞的凋亡。而内皮细胞脂质氧化损伤，凋亡的发生与一系列疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、缺血复灌损伤以及伴随有血管内溶血的一些器官损伤等。然而Balla等发现heme进入内皮细胞一段时间后可以对抗后面的H2O2以及低密度脂蛋白氧化所致内皮细胞氧化损伤。有文献证实急性的heme释放引起氧化应激反应，刺激内皮细胞血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)的合成增加，HO-1可以分解heme生成一氧化碳(CO)、铁离子和胆绿素(biliverdin)，胆绿素很快在体内代谢成为胆红素，胆红素是目前公认的抗氧化剂之一。因此有人认为血红素有此抗氧化作用应归属于它对HO-1的诱导作用。 氯化高铁血红素(hemin)属于血红素的一种，目前发现其具有广泛的生物学效应。有人发现hemin可以降低原发性高血压大鼠的血压，也可以减轻由于缺氧导致的肺动脉高压。Togane等人发现hemin可以对抗球囊损伤模型对血管平滑肌的损伤，同时Aizawa等人证明hemin可以对抗球囊损伤模型引起的鼠颈动脉损伤。hemin对血管系统的保护作用机制未明，可能与其诱导HO-1的合成有关。 Erk1/2是丝裂原蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)家族成员之一。MAPK家族属于丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，广泛参与到多种胞外刺激的胞内信号传导途径。哺乳动物细胞中MAPK家族主要包括：Erk1/2，c-Jun氨基末端激酶(c-Junamino-terminalkinases，JNK)以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)。其中Erk1/2主要是参与各种生长因子的胞内信号传导，JNK和p38MAPK主要是参与各种应激刺激的胞内信号传导。 hemin是否与血管内皮细胞中重要的信号分子Erk1/2的磷酸化水平改变存在一定联系目前尚未见报道。因此本实验的目的是探讨hemin对血管内皮细胞磷酸化Erk1/2是否有诱导作用；有研究表明H2O2可以引起细胞中Erk1/2磷酸化，因此在本实验中我们将进一步观察H2O2是否参与了hemin对内皮细胞Erk1/2的磷酸化作用，以及hemin诱导产生的HO-1和它自身的代谢产物是否也参与了hemin对血管内皮细胞磷酸化Erk1/2的诱导。 方法1.细胞药物处理在细胞血清饥饿16h后给予不同浓度hemin(1，5，10，25，50μmol/L)或100μmol/LH2O2于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养不同时间后，收集细胞观察Erk1/2磷酸化情况。 ZnPP为HO-1阻断剂，Hb为CO清除剂，DFOM为铁离子鳌合剂。在本实验中，将HUVEC细胞在无血清条件下首先分别与5μmol/LZnPP、25μmol/LHb、50μmol/LDFOM共育2h后，然后给予10μmol/Lhemin与HUVEC细胞共育2h后，收集细胞，观察Erk1/2的磷酸化情况。 2.Westernblot将处理后的细胞经胰酶消化收集后，加入细胞裂解液裂解，离心取蛋白沉淀。Lowry法测蛋白浓度。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，蛋白转移至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜2h，洗膜后加入一抗，4℃反应过夜，次日洗膜3次共15min，随后加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温反应1h。洗膜，加入ECL显色剂，X片显影。 3.流式细胞仪分别收集经不同药物浓度处理组和对照组处理细胞，收集各组细胞均匀打散，用PBS反复冲洗3～5次，置于70％乙醇中4℃固定，用碘化丙啶(PI)对样本DNA荧光染色，然后采用流式细胞仪作细胞周期采样分析及细胞凋亡分析。 4.MTT用RMPI1640(含10％新生牛血清)细胞培养液调整细胞浓度为1×104/L的细胞悬液，加入96孔细胞培养板内，置于37℃、5％CO2条件下常规培养24h后，弃培养上清液，用37℃预温的RMPI1640冲洗1次。实验组药物的终浓度分别为10μmol/Lhemin、10μmol/Lbiliverdin，每个药物浓度做6个复孔，空白对照组除未加任何药物外，其余条件完全一致。于用药后24h加入pH7.4PBS配制的5g/LMTT20μl/孔，再置37℃、5％CO2条件下4h。弃去上清液，加入DMSO0.2ml/孔，混匀30min后在酶联检测仪上570nm波长处测A570值，据此计算各药物对HUVEC细胞生长的影响。 结论10μmol/Lhemin诱导并维持了HUVEC细胞Erk1/2的磷酸化。H2O2没有参与hemin对HUVEC细胞磷酸化Erk1/2的诱导作用，Erk1/2的磷酸化可能与hemin诱导血管内皮细胞血红素氧合酶的合成，以及自身分解产生的胆绿素有关。10μmol/Lhemin对HUVEC细胞凋亡没有影响，且对HUVEC细胞的生长具有一定的促进作用。

目录

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

综述 血红素氧合酶系统的生物学活性

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