急性颅脑损伤后脑脊液蛋白质指纹图谱的改变及其意义的研究

摘要

引言：颅脑损伤是当今威胁人类生命的主要疾患之一，尽管我们对颅脑损伤的研究不断深入，但颅脑损伤仍有高伤残率和高致死率。常规的颅脑损伤诊断多依赖于CT(X线电子计算机断层扫描)、MRI(磁共振成像)、SPECT(单光子发射计算机断层扫描)等神经影象学技术，这些诊断工具在判定病人的一般脑功能状态上是有价值的，但它们缺乏对脑损伤程度的精确及量化的评估。在颅脑损伤急性期，是治疗干预最可能起作用的时候，没有精确生物标记物的评估严重限制了治疗干预。客观上要求探索有诊断价值的生物标记物，以弥补GCS评分和影像学诊断的不足。 研究表明，原发的颅脑损伤可引发一系列分子、细胞的级联反应，产生基因蛋白质表达变化，导致神经细胞损伤或死亡。因此检测单一或数个指标对颅脑损伤诊断、监测和预测预后，不可避免地存在敏感性和特异性矛盾。蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质，提供了一组蛋白质的功能及其模式的信息，能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响的结果，因此深入研究颅脑损伤的发生发展的过程，客观上需要在蛋白质组的水平进行进一步的探索。SELDI-TOF-MS(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlight-MassSpectrometry，表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱)技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法，由于SELDI蛋白质芯片技术的高灵敏度及高通量特性，能反映检测样本中蛋白质的全貌，从而同时找到多个蛋白质标志物。故我们在本次研究中希望应用蛋白质指纹图谱SELDI-TOF-MS技术，分析脑脊液中的蛋白质组在颅脑损伤后表达的变化，筛选敏感特异的生物标志物，试图发现可以用于提示病情变化、判断预后的生物标记物，指导治疗的靶标。 材料与方法 1病例选择与分组 组1：轻度颅脑损伤(10)和重度颅脑损伤(9) 19例样本，轻度颅脑损伤10例，重度颅脑损伤9例。轻度颅脑损伤10例，年龄20-46岁，平均年龄31.5岁，GCS评分均为15分，均有昏迷史，昏迷时间在15分钟内，CT扫描颅内无明显血肿，临床诊断为：可疑或少量蛛网膜下腔出血及可疑或轻度脑挫裂伤，脑脊液采样时间为伤后18-25小时。重度颅脑损伤9例，年龄17-39岁，平均年龄30岁，GCS评分为6-8分，CT扫描颅内无明显血肿，临床诊断为：弥漫性轴索损伤，脑脊液采样时间为伤后22-25小时。以上所采集的脑脊液肉眼观均为淡血性。 组2：重度颅脑损伤(3)和其伤后2天自身对照(3)及伤后3天自身对照(3) 重度颅脑损伤3例，GCS评分为6-8分，CT扫描颅内无明显血肿，临床诊断为：弥漫性轴索损伤。脑脊液连续采样，时间为伤后22-25小时；46-48小时，70-72小时 2设备表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlight-MassSpectrometry，SELDI-TOF-MS)，(PBSII+，CiphergenInc.美国)。主要参数：收集范围为1000-100000；优化范围为2000-20000 3芯片H4疏水性表面的化学芯片 4脑脊液样本处理对部分蛋白质浓度高的脑脊液样本根据其蛋白质浓度稀释，使样本的蛋白质浓度在0.3-0.9mg/ml范围内；96孔蛋白质芯片工作平台(Bioprocessor)用50ul乙晴预处理两次，每次各5分钟；将脑脊液样本各取100ul加入Bioprocessor结合60分钟；用200ul去离子水冲洗芯片，取出芯片风干后点1ul50％SPS两次，两次之间放置5分钟让其自然风干；上机读片。 5生物信息学方法本实验数据采用浙江大学肿瘤研究所的 ZUCI-ProteinChipDataAnalyzeSystem软件包分析，用支持向量机方法建立判别模型，用留一法交叉验证作为评估判别模型效果的方法。特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法。 5.1初步筛选每组有统计学差异的m/z；对每个质荷比峰做Wilconxon秩和检验， 5.2生物信息学软件分析数据，用训练集建立判别模型，用测试集检验模型的效力；进一步筛选用于建模的m/z；选出p值最小的10个峰进一步分析。将10个峰的任意组合用于支持向量机模型的输入，用留一法评估模型的预测效果，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组合作为最终的候选标志物， 5.3评价各模型测试集的敏感性、特异性、用留一法交叉验证，每次用除了某一病例外的其余所有病例的数据做为训练集建立函数，再把这一未参与函数构建的病例数据做测试集代入函数进行判别，如此判别每一个病例。 结果 1、轻度颅脑损伤和重度颅脑损伤的蛋白质质谱数据中25个m/z，对每个质荷比峰做Wilconxon秩和检验，分析得到前10个m/z强度的的p值都小于0.05，m/z位于8571、13355、8605、4852、6685、2011、5408、8933、2415的蛋白质峰。除7612在重度颅脑损伤中低表达外，其余9个峰均在重度颅脑损伤中高表达。 2、将10个峰的1023种任意组合用于支持向量机模型的输入，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组合作为最终的候选标志物，它们分别是m/z位于8571、5408的蛋白质峰。将19例样本用留一法交叉验证，重度颅脑损伤的敏感度为100％，轻度颅脑损伤的特异性为100％。 3、重度颅脑损伤的8605M/Z峰，在伤后24小时、48小时、72小时均可检测到，且在自身比较中，表达呈现为明显的逐渐下降趋势。 结论 1、为了进行人颅脑损伤后脑脊液的差异蛋白质组表达谱研究，我们建立了针对人脑脊液的蛋白质组为对象的，以SELDI-TOF-MS质谱技术、支持向量机法、留一法交叉验证法等为基础的技术平台。 2、颅脑损伤可引起脑脊液蛋白质表达谱变化。不同的损伤程度，可产生明显截然不同的临床症状、病理生理反应，直接影响预后。在急性轻、重度颅脑损伤后24小时的脑脊液蛋白质组表达谱变化的研究中，我们没有发现明显的所谓“有或无”(“presentorabsent”)特点的蛋白质峰存在。但是，在轻度与重度颅脑损伤比较中我们发现了10个有统计学差异的蛋白质峰：m/z位于8571、7612、13355、8605、4852、6685、2011、5408、8933、2415的蛋白质峰。在重度颅脑损伤组中，有9个蛋白质峰表达上调，这些蛋白质谱的表达变化，可提示作为评价创伤程度的指标。 3、2个m/z位于8571、5408的候选生物标志物，在重度颅脑损伤与轻度颅脑损伤比较中建立的判别模型中，敏感性和特异性分别为100％和100％，显示了良好的判别能力，为颅脑损伤的评估提示了新的方法。 4、对重度颅脑损伤伤后24小时、48小时、72小时的脑脊液蛋白质质谱数据进行比较，发现M/Z位于8605的蛋白质在伤后24小时、48小时、72小时均可检测到，显示连续存在的趋势。且在自身比较中，表达均呈现为明显的逐渐下降趋势。表明重度颅脑损伤后部分差异蛋白质有时序性变化。 5、在不同程度的颅脑损伤后、在颅脑损伤后的不同时间，神经系统中的蛋白表达水平会产生不同的变化，参与伤后不同的病生理反应，发挥其应有的生理作用，这些蛋白质峰可能是颅脑损伤的生物标志蛋白，对其进行进一步研究，有望深入了解颅脑损伤的分子机制，并用于颅脑损伤的诊断和治疗。

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

蛋白质组学技术在颅脑损伤研究中的应用进展

致谢