抗原B诱导泡球蚴肝移植后免疫耐受的机制研究

摘要

针对泡球蚴肝移植中面临的寄生虫感染免疫和移植免疫交织而凸现出来的临床问题，本课题尝试观察抗原B在诱导泡球蚴肝移植后免疫耐受中的作用和机制。首先对包虫病患者的体液免疫和细胞免疫状态进行了研究，比较了包虫病患者血清IgG，IgA，IgM，IgE等抗体的水平及Th1，Th2细胞因子的水平与正常人群的区别；通过泡球蚴感染的大鼠肝移植模型，观察了肝脏病理和细胞因子的变化；制备了人工重组抗原B，探讨抗原B在包虫免疫逃避中的作用及诱导宿主免疫耐受形成的机制；利用人工重组抗原B真核表达的单链可变区抗体，观察了该抗体对原头节的杀伤作用。目的是以抗原B及其特异性抗体为研究工具，观察泡状棘球蚴感染引起的宿主免疫耐受状态对泡状棘球蚴大鼠肝移植后移植肝存活的影响，细胞免疫，体液免疫状态的变化特点及其与抗原B的关系，为今后使用抗原B治疗靶点，诱导机体的自发耐受，用抗原B的特异性抗体阻断复发或再感染，指导移植手术后免疫抑制剂使用方案奠定实验基础。 材料和方法首先对64例肝包虫病患者和58例门诊健康体检人群进行体液免疫和细胞免疫的检测，测定内容包括：血清总抗体和补体(IgA，IgG，IgM，IgE水平及C3，CRP)，人体包虫病特异性抗体(头节，囊液，抗原B，EM2)，血清细胞因子(可溶性白介素2受体，血清白介素2，4，8，10和IFN-γ) 建立人工感染腹腔泡球蚴的动物模型，分感染组，未感染组和对照组进行肝脏移植，获得生存时间等基本数据，观察宿主对移植肝的免疫排斥情况，用荧光标记的CD30抗体检测T淋巴细胞在移植肝中的分布。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，检测移植排斥和耐受的受者中Th1和Th2细胞因子中的具有代表性的IFN-γ和IL-4的mRNA的表达水平，探讨IFN-γ和IL-4mRNA表达与移植耐受的关系。 用高速离心法制备囊液天然抗原B，用亲和层析法制备半纯化的抗原B，用基因克隆的方法制备了人工重组的抗原B，人工重组的抗原B与包虫患者脾脏淋巴细胞共同培养的方法来观察代表TH1型的IFN-r和代表TH2型的IL4的表达，用人工重组抗原B与人T淋巴瘤Jurkat细胞共同培养，观察抗原B与人T淋巴细胞共同培养后的细胞形态结构功能变化，DNA断裂试验，彗星试验和TUNEL试验用来从不同时相检测调亡，激光共聚焦显微镜下观察细胞内浓度变化，分析其作用机制。 在已经得到人源化抗包虫病单链可变区抗体(SingleChainFragmentVariable，ScFv)的工作基础上，采用真核表达，体外培养的方法，研究了该人源化抗体在体外抑制人体包虫囊肿原头节生长的作用。 结果观察的64例包虫病患者体液免疫特点为：血清总抗体水平IgA无显著差异，而IgM，IgE水平均高于正常对照组(P均＜0.05)，而IgG的升高更为明显(P＜0.01)，包虫病患者血清四种抗包虫病的特异性抗体显著升高(P＜0.01)，血清补体和急性反应蛋白的水平略高，但无统计学差异，细胞因子变化的特点为：由Th1细胞分泌的IL-2、IFN-γ和sIL-2R等细胞因子中，IL-2和sIL-2R显著降低；Th2分泌的IL-4、IL-8和IL-10中IL-4、IL-8显著升高。包虫病患者的Th1和Th2平衡失调，处于免疫抑制状态。 通过腹腔注射新鲜处理的原头蚴组织制备大鼠继发泡球蚴感染模型的技术路线可行，对照组、排斥组、泡球蚴感染90天组、泡球蚴感染50天组受者存活时间平均分别为35天以上，5.2天、8天和5天。感染泡球蚴较未感染组显著延长，差异有统计学意义，泡状棘球蚴感染后移植肝中Th2类的细胞因子IL-4在泡球蚴感染组呈现高表达，在排斥组中低表达，而Th1类的细胞因子IFN则相反，说明了泡球蚴干扰能造成Th1类细胞因子向Th2类偏移，这种“免疫偏离”有助于建立泡球蚴感染的移植免疫耐受，从而有利于同种异体移植物的存活，移植肝中T淋巴细胞显著减少，提示寄生虫感染抑制了抗原特异性T细胞的免疫反应，寄生虫抗原抑制了T淋巴细胞，诱导宿主对抗原特异性的无应答反应，从而诱导耐受。 制备的囊液粗抗原成分复杂，大分子量组分多，免疫反应灵敏度高，交叉反应严重，半纯化抗原B去除了大分子物质，集中在12KD和20KD左右，有一定的交叉反应，而人工重组抗原B组分单一，紫外扫描中显示为光滑单一的210nm处的吸收峰，蛋白电泳和Western-blotting显示抗原B为12KD蛋白。 包虫病人肝脏中抗原B的定位和免疫组化结果表明：包虫患者肝组织抗原B大量表达，阳性颗粒定位于肝细胞胞浆，阳性细胞呈散在分布，抗原B刺激包虫病人脾淋巴细胞后可引起IL-4分泌增高，IFN-γ分泌降低，Th1向Th2漂移，体外实验中抗原B作用于淋巴细胞后引起人JurkatT淋巴细胞凋亡，诱导抗原特异性T淋巴细胞凋亡是抗原B作用下机体产生免疫耐受的可能原因之一，抗原B诱导抗原特异性T淋巴细胞凋亡的靶点和可能的机制是通过引起细胞内Ca2+浓度升高。 抗棘球蚴抗原B的人源单链可变区抗体(ScFv)通过真核表达载体p-EGFP-N3瞬时转染COS-7细胞，使单链抗体获得了高水平的表达，经SDS-PAGE和Westernblot分析，该单链抗体具有与原头节结合的特异性，体外培养实验表明人源化的ScFv对人体包虫原头节有抑制作用，高剂量组(1mg/L)显示出明显的抑制作用，而中(0.1mg/L)、低(0.01mg/L)剂量组与对照组的原头节死亡率无统计学差异，提示效果与ScFv剂量有关，在高剂量ScFv组可以看到随着作用时间的延长，在第5～7天原头节出现不同程度的皱缩、坏死、崩解等变化，提示ScFv的作用与时间有关，抗棘球蚴抗原B的人源单链可变区抗体是一个研究包虫免疫机制的分子工具，具有人源化特点，有希望成为调节包虫病肝移植后免疫状态阻止包虫病复发的药物。 结论患泡球蚴肝脏的移植免疫特性是感染泡球蚴后在抗原B刺激下T淋巴细胞的Th2型优势导致宿主免疫抑制，移植手术后抗原特异性T淋巴细胞凋亡，细胞凋亡使得向移植物浸润的T细胞被迅速清除，造成了机体的免疫耐受，减轻了急性排斥反应的风险，但这种免疫抑制状态合并免疫抑制剂的使用使得泡球蚴复发风险增高，抗原B特异性人源单链可变区抗体有助于杀灭原头蚴防止复发。

目录

缩略词表

前言

第一部分 包虫病患者体液免疫和细胞免疫状态的检测

第二部分 Th1Th2细胞因子mRNA的表达与泡球蚴感染后肝移植大鼠免疫耐受的关系

第三部分 抗原B的粗提蛋白，半纯化蛋白和人工重组蛋白的制备，鉴定和比较

第四部分 抗原B诱导T淋巴细胞凋亡的体外实验研究

第五部分 抗棘球蚴抗原B的人源单链可变区抗体(ScFv)的真核表达及抑制人体包虫原头节的实验研究

综述 泡球蚴肝移植，包虫抗原B与宿主免疫反应的研究进展

在校期间发表论文及学术会议

致谢