人骨髓间充质干细胞在大鼠脑内移植的研究

摘要

骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)又称骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)，是骨髓中除造血干细胞外的一种多向分化潜能的成体干细胞，是目前干细胞研究的热点和前沿。MSCs具有方便获取、易于分离培养和扩增纯化，在体外培养条件下多代扩增后仍保持多向分化潜能的特点，且遗传背景稳定，体内植入后免疫排斥反应弱，体外基因转染后能长期稳定表达外源基因。近年研究发现MSCs具有跨系统、跨胚层分化的潜能，即不仅具有向中胚层分化的能力，而且具有向内胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力。尤其MSCs向神经细胞系转分化的体内、外研究引起广泛兴趣。诸多学者将自体或同种异基因MSCs通过脑内局部注射、腹腔内注射或静脉输注等方法移植至多种神经元变性疾病动物模型中，包括局灶性脑缺血(即脑梗塞)、脑出血、脑外伤、帕金森氏病等，研究发现自体或异基因MSCs植入后能归巢至脑内损伤部位，长期存活，部分细胞分化为神经元或神经胶质细胞，甚至能显著改善神经系统功能。因此，MSCs在神经系统中有着广泛的应用前景。但MSCs在缺氧缺血导致的弥漫性脑损疾病的研究国内、外报道并不多。此外，啮齿类动物来源MSCs在神经损伤疾病中的神经保护效应已被广泛证实，而人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体内的研究较少。由于MSCs独特的免疫学特性，有学者将异种MSCs植入免疫功能健全大鼠脑内，结果用或不用免疫抑制剂，MSCs均能在体内长期存活，且未见明显免疫排斥反应。因此，本实验探讨未用免疫抑制剂下，hMSCs在免疫功能健全的异种动物体内能否存活、迁移、分化，能否促进大鼠缺氧缺血导致的弥漫性脑损伤的修复。 实验动物随机分为4组：hMSCs移植组(n=18)，移植对照组(n=18)，模型组(n=6)和假手术组(n=6)，前三组采用Rice法建立幼年Wistar大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型。采用密度梯度离心贴壁法分离培养hMSCs，传代培养后，取3-5代hMSCs，移植前加入胸腺嘧啶类似物：5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)连续标记72h，消化收集细胞调整浓度为5×104个/ul。缓慢注射约5×105个hMSCs(5ul×2个注射点)至hMSCs移植组大鼠左背侧海马，移植对照组注射等体积的PBS，模型组和假手术组大鼠分别只制备HIBD模型和假手术模型，未作移植。4组大鼠均未用免疫抑制剂。 hMSCs移植组与移植对照组分别于移植后0d，3d，1w,2w,4w处死，模型组和假手术组于造模后31d(即移植之日后4w)处死。4组于移植后4w处死前行交替电刺激Y迷宫行为学试验表明，hMSCs移植组大鼠空间记忆能力显著优于移植对照组大鼠，而hMSCs移植组与假手术组，移植对照组和模型组大鼠的空间记忆能力无显著性差异。大鼠灌注处死后，脑组织制备石蜡切片，行HE染色观察病理变化，示移植对照组与模型组大鼠脑皮质、海马大量神经元坏死，毛细血管扩张充血、渗血，神经毯疏松、空泡形成，海马CA1区甚至整个海马结构紊乱，大量胶质细胞增生。hMSCs移植组和假手术组大鼠皮质和海马也有部分坏死神经元，但结构正常，无空泡。各组各时间点大鼠处死后，制备石蜡切片，行BrdU、巢蛋白(Nestin)、神经丝蛋白(NF)和神经胶质酸性蛋白(GFAP)免疫组化检测hMSCs在脑内的分布并鉴定有无表达神经元或神经胶质细胞表型。实验显示，移植后1whMSCs主要沿脑室系统迁移，部分细胞沿胼胝体向对侧迁移，移植后4w细胞沿脑室向周围实质迁移，广泛分布于脑组织。移植后3d，移植局部即有部分BrdU阳性细胞表达GFAP，移植周围的血管附近少量BrdU阳性细胞表达NF。各时间点均未见Nestin表达。移植后4w，BrdU、GFAP共表达细胞增多，主要分布在移植局部、海马、皮质、室管膜。 综上所述，本研究得到以下结论： 1.Rice法可成功制备以结扎侧海马、皮质为主的弥漫性脑内神经元进行性坏死的幼年大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型。 2.未用免疫抑制剂下，hMSCs在免疫功能健全的异种(大鼠)脑内至少能存活4周，且大鼠未发生移植相关的死亡。 3.脑内移植后，hMSCs能迁移至损伤部位。 4.在缺氧缺血导致的弥漫性脑损伤微环境下，hMSCs能分化为成熟神经元和神经胶质细胞。 5.移植4周后，hMSCs能明显改善、修复缺氧缺血性脑损伤大鼠的神经系统功能。

目录

第一部分人骨髓间充质干细胞脑内移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤的实验研究

前言

材料与方法

统计方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体免疫组化技术在大鼠模型中应用的研究

综述一 骨髓间充质干细胞的免疫学特性及其在造血干细胞移植中的应用

综述二 骨髓间充质干细胞向神经细胞系转分化的研究进展

致谢