新蚜虫疠霉和根虫瘟霉的黍米培养及其培养物的产孢、侵染与贮存生物学特性

摘要

虫疠霉属(Pandora)和虫瘟霉属(Zoophthora)属于虫霉目(Entomophthorales)的重要成员，也是重要的害虫生防真菌资源。其中，新蚜虫疠霉Pandoraneoaphidis是全世界分布的蚜虫专化性病原真菌，常引发多种蚜虫的流行病，在蚜虫自然控制中发挥着关键作用。根虫瘟霉Zoophthoraradicans能侵染同翅目和鳞翅目等多个类群害虫，是昆虫专化性病原真菌。虫疠霉和虫瘟霉一般对营养条件要求苛刻，其侵染体的人工繁殖相当困难，以致相关研究长期进展缓慢。针对虫霉侵染体繁殖这一普遍性的技术难题，在虫霉固体培养的探索中，用黍米、粟米等谷物作为营养基质成功地获得了新蚜虫疠霉和根虫瘟霉的人工侵染体，由此建立了简便易行的虫霉侵染体繁殖技术体系，评价了黍米培养物对桃蚜Myzuspersicae和小菜蛾Plutellaxylostella的侵染性和毒力，并发现了影响黍米培养物贮存的关键影响因子。主要研究内容和结果分述如下： 新蚜虫疠霉的固体培养采用黍米Panicummiliaceum(俗称黄米)和粟米Setariaitalica(俗称小米)作为营养基质，对专性侵染蚜虫、营养要求苛刻的新蚜虫疠霉F98028菌株进行了侵染体繁殖试验。将半个生长旺盛的平板菌落挑碎，与3ml萨氏营养液混合后接入15g经高温湿热灭菌而适度熟化、含水量适宜的黍米或粟米中，在20℃和12L∶12D条件下直接静止培养。所获3～21天黍米培养物和6～21天粟米培养物的产孢潜能和有效产孢时间因培养天数不同而异。采用自行设计的采孢装置，定量测定20粒黍米或粟米培养物的产孢量。结果表明，培养6-15天的新蚜虫疠霉黍米培养物产孢最好，能持续产孢6天，产孢量达16.8～23.4×104个孢子/粒。相对于新鲜蚜尸的8.4×104个孢子/头，单粒黍米产孢量高出1～1.8倍，有效产孢时间倍增。培养12天的粟米培养物最佳，产孢量为5.6×104个孢子/粒，明显低于黍米培养物。综合考虑米粒大小和产孢量，新蚜虫疠霉黍米米培养物的产孢能力优于粟米培养物，其单粒产孢的潜能和持续产孢时间均远优于单头病死蚜尸。 新蚜虫疠霉黍米培养物的侵染性及毒力用新蚜虫疠霉黍米培养物和培养液菌丝平板作为侵染源分别对桃蚜进行了9个序列剂量的“孢子浴”接种处理和时间—剂量—死亡率数据的模型模拟分析。接种后第4～7天，黍米培养物的LC50分别为124.8、21.4、7.3和4.9个孢子/mm2，而培养液菌丝的LC50分别为175.0、22.1、10.6和7.7个孢子/mm2；LT50的最大值为6.9天时，对应的黍米培养物和液培菌丝所需的孢子剂量分别为5.0和8.0个孢子/mm2。接种孢子剂量越大，二者的LT50值越接近。结果表明，黍米培养物保持了新蚜虫疠霉对寄主固有的侵染性和毒力，其制备方法简单和成本低，因而更具适用性。 新蚜虫疠霉黍米培养物的贮存在20℃下培养15天的新蚜虫疠霉黍米培养物的含水量(Cw)为48.7％，产孢量(Cs)达32.0×104个孢子/粒。将其分装入100mL小烧杯中，分别用保鲜膜(湿度饱和)或报纸封口(环境湿度)，或分别贮存于85％RH和98％RH的恒湿环境中，于不同温度(5、10和20℃)下黑暗贮存200天，定期取样进行含水量和产孢量的测定。结果发现，5℃下报纸封口的处理为最佳贮存方案，其Cw在21～25％范围内波动，贮存120天后的产孢量仍相当于新鲜蚜尸。在5℃下膜封或高湿处理中，黍米培养物在贮存期间始终含水量高而产孢量低，虽贮存更久，但不是好的方案。在10℃和20℃下贮存，最好的处理也不超过40天。不同温度(T)下贮存的黍米培养物的产孢量能很好地拟合复合逻辑斯蒂模型Gs=35.28/{1+exp[-2.36+(-0.003Cw+0.001CwT)t]}(r2=0.95)，5℃下黍米培养物的贮存结果则拟合Cs=35.55/[1+exp(-2.33+0.001Cwt)](r2=0.93)。前一模型中Cs的衰减速率为-0.003Cw+0.001CwT，表明Cw是影响贮存过程中Cs变化的关键因子；后一模型Cs的衰减速率为0.001Cw，显示即使黍米培养物5℃冷贮，其含水量的影响也是决定性的。在5℃最佳条件下贮存的黍米培养物和风干病死蚜尸，具有一致的产孢量衰减速率。这些结果表明，可以通过低温下控制Cw的变化速率和幅度来改善新蚜虫疠霉黍米培养物的5℃冷贮，但并不是Cw越低越好，而是应将其控制在适宜范围内。 根虫瘟霉黍米培养物的产孢、侵染和贮存黍米培养法成功地应用于根虫瘟霉(菌株ARSEF1100)侵染体的繁殖，基本方法与新蚜虫疠霉相同，培养条件为15℃和12L∶12D的组合。从培养第6天起每3天抽样测定20粒黍米的产孢量，以培养12～24天的黍米培养物产孢量最佳，达12.0～14.9×104个孢子/粒，能持续产孢7天；其中以培养21天的产孢达最大，约为小菜蛾病死幼虫尸体平均产孢量(28.7×104个孢子/头)的一半，而小菜蛾虫尸体积约为黍米颗粒的3倍。用根虫瘟霉黍米培养物、小菜蛾虫尸和培养液菌丝平板分别作为侵染源接种小菜蛾2龄幼虫，根据时间—剂量—死亡率数据模拟分析，获得了相似的LC50与LT50值，表明三种来源的接种体对寄主的侵染性和毒力无明显差异。根虫瘟霉黍米培养物5℃下黑暗贮存期间，产孢量Cs(×104个孢子/粒)的变化由含水量(Cw)决定，其衰减趋势拟合模型Cs=3.34/[1+exp(-3.68+1.14Cwt)](r2=0.99)，与5℃下贮存的新蚜虫疠霉黍米培养物的产孢量变化趋势相同，其衰减速率为1.14Cw。因此，根虫瘟霉的黍米培养物也可通过含水量Cw的控制来延长贮存期。 综上所述，以黍米作为营养基质直接培养虫疠霉和虫瘟霉的新方法完全可行。黍米培养物在产孢和侵染生物学特性方面与天然病死虫尸完全一致，可视为虫霉致死虫尸的人工模拟材料。而且，黍米培养物可以通过控制其含水量进行冷贮，保持产孢活力达数月之久。用黍米培养虫霉的方法较之以前的虫霉菌丝体繁殖方法更为简便和成本低，也无需冷冻干燥和粉碎，因而是虫霉侵染体繁殖技术的显著进步。这一技术体系的建立及不断完善将有力地推动虫霉的基础与应用研究不断走向深入。

目录

论文说明：图示目录、表格目录

致谢

1虫霉及其侵染体的繁殖和应用现状

2专性蚜虫病原真菌新蚜虫疠霉的固体培养新法

3新蚜虫疠霉黍米培养物对桃蚜的时间-剂量-死亡率模拟分析

4新蚜虫疠霉黍米培养物的贮存

5根虫瘟霉黍米培养物的生物学特性与功能

6总讨论

参考文献

附：在读期间已发表的相关研究论文