应用基因组学方法筛选FL细胞对微囊藻毒素-LR暴露的应答基因

摘要

自上世纪70年代以来，由于水体富营养化导致世界范围内蓝藻水华频繁发生。由蓝藻的一些种属(主要是铜绿微囊藻)所产生的毒素—微囊藻毒素对人类和动物都构成了严重的影响。微囊藻毒素是一种单环七肽，其中5个氨基酸为固定成分，一般结构为(D-Ala-L-X-erythro-β-methyl-D-isoAsp-L-Y-Adda-D-isoGLu-N-Methldehydro-Ala)，其中Adda(3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoicacid)是一种特殊氨基酸，是微囊藻毒素生物活性所必须的基团。X，Y为两种可变的氨基酸，因此产生60多种同类物。微囊藻毒素-LR(X，Y位分别是亮氨酸L和精氨酸R)是微囊藻毒素中最常见，毒性最大的一种。同位素示踪实验显示微囊藻毒素进入体内后主要分布在肝脏，肾脏和肠道也有不同程度的蓄积，提示这三个器官是它的靶器官。大量的体外实验表明微囊藻毒素对很多不同种类的细胞都具有毒理学作用，包括肝细胞、肾细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞及淋巴细胞。 目前对于微囊藻毒素致毒的分子机制的研究主要从以下的几个方面进行：蛋白磷酸酶PP1和PP2A的抑制，对细胞骨架的影响，氧化损伤，细胞调亡，细胞增殖，DNA损伤等，但还远没有阐述清楚，甚至还存在一些矛盾的地方如微囊藻毒素能介导细胞凋亡而同时也能促进细胞增殖及促癌症发生。作为一种外来的污染物，它进入细胞后对细胞功能的影响必然是十分广泛的，更多的被毒素作用的靶分子是否存在？为了更好地阐述微囊藻毒素诱导后参与细胞应答反应的靶分子，传统的方法已不能满足高通量的需求。随着人类基因组计划的完成，研究人员开始从整体上通过全面认识基因组的转录和表达来揭示生命活动的规律和机制。基因芯片技术的诞生为系统和全面的研究基因的转录提供了有效的工具，通过基因芯片技术可以高通量检测人类几乎所有基因的转录状态。比较不同细胞、组织、不同发育阶段和不同生理病理状态、不同环境刺激因素反应的基因转录表达情况，从而阐明各自生命活动和疾病的规律及其分子机制。 因此本研究应用Affymitrix公司的人类全基因组表达谱芯片和ABI公司的低密度表达谱芯片来高通量的研究微囊藻毒素暴露后的差异表达基因，研究可能存在的差异表达基因与毒素作用的浓度和时间之间的关系。同时通过生物信息学方法对差异表达基因进行分类，探讨不同功能基因的表达改变在微囊藻毒素产生细胞毒性中的作用。 结果：1.两种芯片共检测到差异表达基因近2000个，这些基因编码的蛋白涉及细胞的多种功能，包括：细胞凋亡，细胞周期调节，细胞生长和分化，转录调节，信号转导，新陈代谢，细胞结构组成等。 2.研究发现有50个基因在1μM微囊藻毒素-LR处理的不同时间处理组均发生表达改变。 3.通过两种芯片检测结果的比较发现13个基因在两种芯片实验中均有表达改变，而这些基因未见报道与微囊藻毒素-LR的致毒机制相关。 结论：1.微囊藻毒素-LR作用后细胞内发生了广泛的变化，有众多的基因参与了应答，这些基因的编码产物涉及细胞的不同功能。 22.研究发现只有少数基因具有时间依赖关系，而其他绝大部分的基因不具有时间依赖关系，这说明不同时间微囊藻毒素暴露细胞应答反应机制是不一样的，长时间暴露后的细胞应答反应不是短时间暴露后的延续，而是存在更为复杂的致毒机制。 3.这些具有时间依赖关系的基因其表达变化在微囊藻毒素暴露的各个时间处理组均出现，可能可作为微囊藻毒素暴露新的生物标志物，也提示这些基因可能在微囊藻毒素的毒作用中起了更为重要的作用。

目录

摘要

前言

实验材料

研究方法

结果

讨论

结论

参考文献

内质网应激和细胞凋亡

在读期间参与的科研项目和发表文章

致谢