野生迁徙水禽流感病毒感染的流行病学分析与鸭H5亚型禽流感抗体ELISA监控技术研究

摘要

本研究对中国境内的迁徙候鸟进行了禽流感流行病学分析，在2004-2005年间，分别从中国境内的7个野生鸟类自然保护区中采集了15种野生水鸟，共458份血清样本和1052份拭子样品，通过血凝抑制试验，运用H2-H13亚型的禽流感标准抗原检测血清的流感抗体，结果在白鹭、夜鹭、斑尾塍鹬、中杓鹬、青脚鹬几个品种鸟类中检测到有抗H2，H9，H10亚型流感病毒的低水平抗体(3log2)，而其它迁徙鸟类中未检测到A型禽流感病毒抗体；病原分离方面：除斑头雁外，未能从其它迁徙鸟中分离到禽流感病毒。通过亚型鉴定表明所分离的病原为H5亚型高致病禽流感病毒，抗原分析发现，该分离株与其它几株地方流行株存在一定的抗原差异。 通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增了禽流感病毒A/Bar-headedGoose/Qinghai/0510/05的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA基因，将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定：并将克隆到的8个基因片段与GenBank发表的相应基因序列进行比较分析，绘制8基因的进化树。结果表明：所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架；A/Bar-headedGoose/Qinghai/0510/05病毒与CK/ST/4231/03和Peregrinefaclon/HK/D0028/04毒株得同源性最高，HA进化分析发现与A/Goose/Guangdong/1/96和A/Goose/Guangdong/3/97亲缘关系较远；推导的HA氨基酸序列分析，A/BhGoose/QH/0510/05的血凝素(Heamgglutinin，HA)裂解位点符合高致病性禽流感的分子特征(ERRRKKR/G)，第226位氨基酸是对禽类和哺乳细胞均具有亲嗜性的蛋氨酸(Met)。神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)在第48位氨基酸(颈部)后有20个氨基酸的缺失。碱性聚合酶2(PB2)的627位氨基酸是亲哺乳类细胞的赖氨酸(K)。研究结果说明A/Bar-headedGoose/Qinghai/0510/05病毒为一株高致病性强毒株。 研究了一株分离自斑头雁的H5N1禽流感病毒(A/Bar-headedGoose/Qinghai/0510/05(BhH5N1))对各种家禽和小鼠的致病性。通过静脉接种，测定该病毒对鸡的静脉内致病指数，判定病毒毒力；同时通过滴鼻感染方式人工感染鸡、鸭、鹅和小鼠，观察BhH5N1对各种动物的致病性。研究结果表明：BhH5N1病毒对鸡的IVPI为2.9，属高致病力强毒株，鸡、鸭、鹅和小鼠在感染BhH5N1毒株后均出现明显的临床症状，引起禽类和哺乳动物全身性感染，并导致感染鸡和小鼠100％死亡，感染鸭和鹅80％死亡。通过对各组织病毒滴度测定发现感染鸡、鸭、鹅组织中的病毒滴度比小鼠高，但组织病变鸡、鸭和小鼠比鹅更严重，说明鹅对BhH5N1病毒的抵抗力比鸡、鸭、小鼠强。在检测感染鸭、鹅的咽、肛拭子时发现咽拭子中的病毒含量比肛拭子中高，推测流感病毒主要通过气流及污染的水源进行传播。根据各项研究结果说明BhH5N1病毒对于家禽和小鼠来说都为高致病性强毒株。 参考GenBank中已发表的H5亚型AIV的HA基因序列，设计合成两条特异性引物，通过RT-PCR方法扩增和克隆了AIV/CK/Jiand/2002(H5N1)毒株的完整HA基因，并将HA1基因片段定向插入原核表达载体pET-28(a)中，转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)。重组菌用IPTG诱导表达，实现了重组AIV/H5亚型HA1蛋白的原核表达。SDS-PAGE和Wstern-blot分析显示，表达蛋白的分子量约为40.0kDa，能与鸭抗H5亚型禽流感病毒阳性血清发生特异性反应。可溶性鉴定表明，表达的蛋白主要以包含体形式存在。表达的重组蛋白采用Ni2+亲和纯化，用纯化的重组HA1蛋白免疫BALB/c小鼠，取其睥细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，成功获得7株能稳定传代并分泌抗AIV/H5亚型HA1蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞，对7株mAb初步鉴定结果表明，其抗体类型均为IgG1，轻链都为κ链。腹水的间接ELISA效价介于1：6400～1：12800之间。Westernblot分析表明，所获得的7株单克隆抗体与HA1蛋白具有反应性，推测它们是针对序列决定簇的. 无菌收集鸭血清，用辛酸-硫酸铵法提取鸭IgG，SephadexG100柱层析进一步纯化，SDS-PAGE分析显示鸭IgG纯度较高，分光光度计测定鸭IgG浓度为6.0mg/ml。用纯化的鸭IgG分别与福氏完全佐剂和不完全佐剂乳化后，免疫4只健康新西兰白兔，经过三免后，用琼脂凝胶扩散试验检测抗体效价达到1：64时，心脏采血，无菌分离兔血清，用同样方法纯化兔IgG，SDS-PAGE分析表明兔IgG纯度高，符合制备酶标二抗的要求；采用过碘酸钠氧化法将兔IgG与辣根过氧化物酶连接，即得酶标兔抗鸭IgG，其抗体的克分子比为1.85；通过Dot-ELISA检测酶标抗体质量，发现HRP标记兔抗鸭IgG在1：500倍稀释时可以与1024倍稀释的鸭抗AIV/H7亚型阳性血清反应。 以原核表达的禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白为标准抗原，通过对抗原包被浓度和血清稀释液等反应条件进行优化，建立了检测鸭H5亚型禽流感抗体的间接ELISA(HA1-ELISA)方法。所建立的HA1-ELISA方法抗原包被浓度为2ug/ml,血清最佳稀释度为1：100倍稀释；包被抗原能特异与鸭抗AIV/H5亚型阳性血清反应，而不与鸭的其它病毒阳性血清发生交叉反应；此法重复性好，其批内、批间的CV值均在4％以内；在检测449份鸭血清田间样品时，HA1-ELISA检测出263份阳性血清，186份阴性血清，而HI试验检测出249份阳性血清，200份阴性血清，两者的吻合率为92％，同时HA1-ELISA敏感性高于HI试验。研究结果都表明，本文所建立的检测鸭H5亚型禽流感抗体的间接ELISA方法具有高度敏感性和特异性，在水禽流感抗体的监测方面有重要的应用价值。

目录

本论文的创新点

摘要

第一部分文献综述

第二部分研究内容

第一章 2004-2005年中国境内迁徙鸟类的流感病毒流行病学分析

第二章 A/Bar-headed Goose/Qinghai/0510/05毒株基因序列分析

第三章 A/Bar-headed Goose/Qinghai/0510/05毒株的致病性与跨种间传播能力的研究

第四章 H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白表达与单克隆抗体的制备

第五章 酶标兔抗鸭IgG的制备

第六章 检测鸭H5亚型禽流感抗体的间接ELISA方法建立

参考文献

附录A 常用缓冲液及培养基配方

致谢

攻读硕士期间的科研成果