醒脑静注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

摘要

研究背景：脑血管疾病是目前危害人类健康的三大疾病之一，其中，缺血性脑血管疾病以其高发病率，高致残率和高死亡率，而严重危害着人们的身体健康。 脑缺血损伤以往认为是由急性能量衰竭导致的细胞坏死所造成的，但脑循环障碍未进一步加重时，神经功能缺损仍进行性加重，神经元的急性坏死显然无法解释，从以往动物实验观察到，这种延迟损伤的机制主要为凋亡。20世纪90年代以来，人们发现脑缺血后神经损伤中除坏死外，还存在凋亡现象，细胞凋亡是造成脑缺血再灌注后迟发性持续神经细胞损伤不可忽视的重要因素。随着研究的深入，凋亡在脑缺血再灌注损伤中的地位越来越明显，其发展进程直接关系到脑损伤程度和梗死范围，并影响患者的预后和功能恢复。 从我国国情看，当患者发生脑血管意外后送至医院，待诊断明确，往往已失去溶栓治疗的最佳时机，故缺血性脑血管病的治疗成功率一直很低，缺血中心区的坏死发生较早，这部分脑组织的挽救相当困难。而随着时间的延长，坏死已终止，凋亡仍在进行，故当前世界上对缺血性脑损害的防治重点己从溶栓治疗转向对缺血半暗区神经元的缺血再灌注损伤的保护。另一方面，在危重病例的救治过程中，如心肺骤停复苏后，严重休克纠正后，亦都存在着脑缺血再灌注的问题。 脑缺血再灌注损伤的机制是一个复杂的多因素过程，目前尚未完全阐明。近年来，国内外学者在大量的实验研究基础上，提出了多种学说：如氧化应激反应学说，炎症反应，细胞因子学说，钙超载学说，细胞凋亡学说以及兴奋性氨基酸学说等。脑缺血再灌注过程中可产生大量的氧自由基，造成脂质，蛋白质和核酸过氧化，细胞膜破坏，最终导致神经元损伤。氧自由基尤其是超氧阴离子是局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的主要因素。 醒脑静注射液是我国著名中药安宫牛黄丸的精制静脉注射液。临床上主要用于各种昏迷和脑血管意外病人，效果显著。多位学者采用格拉斯哥昏迷积分，评价其对急性脑血管病意识障碍具有促醒作用，但其作用机制往往是沿用中医理论解释，限制了其使用范围，尤其是难以向国外医学界推广。 我们推测，醒脑静的这种临床作用，是否能防止在脑缺血再灌注损伤中占重要地位的凋亡进程，以及其能否抑制在脑缺血再灌注过程中引发的超乎寻常的过氧化反应。为此，我们设计了该实验，拟从通过观察大鼠脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性的变化和神经细胞凋亡率，探讨醒脑静注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的机制。 研究目的：通过观察大鼠脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的变化和神经细胞凋亡率，探讨醒脑静注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的机制。 研究方法：1、实验动物和主要试剂：健康雄性SD大鼠100只，体重200～250g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。醒脑静注射液，由无锡健宏药业有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒由南京建成生物工程研究所生产；凋亡检测试剂盒由德国宝灵曼公司提供。 2、实验方法：采用Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。随机将100只SD雄性大鼠分为13组：假手术组4只，醒脑静组和对照组分别为缺血再灌注2、4、8、24、48、72小时各6组，每组8只。于缺血同时醒脑静组大鼠给予腹腔注射醒脑静注射液1mi/100g/day，对照组腹腔注射同等量的生理盐水，假手术组其它操作同对照组，插线深度为10mm。 3、标本采集和检测：每组于再灌注相应的时间后快速断头处死，完整剥取脑组织，其中每组的半数用于脑组织匀浆液的SOD、MDA检测，另半数用于凋亡染色。SOD、MDA测定：所有脑组织匀浆液标本集中统一用黄嘌呤氧化酶法测定SOD；用硫代巴比妥酸法测定MDA，严格按试剂盒操作步骤完成；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色法检测凋亡细胞。于缺血周边区不重复随机选取6个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算凋亡阳性细胞率(凋亡阳性细胞数/总细胞数×100％)。 4、统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间两两比较用t检验，P＜0.05有统计学意义。 研究结果：实验过程中，有6只大鼠考虑因麻醉意外死亡，补充6只进入实验，最后进入结果分析的大鼠为100只。 1、脑组织匀浆液SOD和MDA的变化：与假手术组相比，缺血再灌注后，醒脑静组和对照组的脑组织匀浆液SOD活性明显下降；MDA浓度显著升高。醒脑静组上述两项指标的变化与对照组相比明显减弱，有显著性差异；动态观察可见：SOD，MDA的改变从再灌注早期即出现，2小时即有明显增高，随着缺血再灌注时间的延长，这种改变更明显，至24小时后出现回落。 2、凋亡染色检测结果：缺血再灌注对侧脑组织(左侧)和假手术组脑片中未出现神经元凋亡；脑缺血再灌注后2小时内亦未见有凋亡阳性细胞，于再灌注后4小时开始出现，凋亡细胞阳性率随着再灌注时间的延长进行性增高，一直至72小时未见有下降趋势；凋亡细胞主要分布在缺血半暗带区，细胞缩小，变形，浓染，呈深蓝色。使用醒脑静后，醒脑静组较相应时相点对照组凋亡细胞减少，有显著性差异。 结论：脑缺血再灌注能使体内氧化系统被激活，脑组织中氧自由基水平升高，参与脑缺血再灌注损伤，神经元凋亡是这种损伤的重要形式，醒脑静注射液可明显抑制氧自由基水平升高和细胞凋亡，具有脑保护作用。

目录

前 言

材料和方法

结果

讨 论

结 论

参考文献

综述 脑缺血再灌注损伤的机制及醒脑静注射液的临床应用

致 谢