铝调控饭豆根系柠檬酸分泌机制及酵母表达人工设计的酸性多肽片段以提高抗铝性的初步研究

摘要

铝毒是限制酸性土壤上作物生产的主要因子。一些植物或基因型拥有耐铝机制以解除或者减轻生长介质中的铝毒。Al胁迫下，植物根系有机酸的分泌被认为是最为重要的抗铝机制，根据Al胁迫下有机酸分泌时间响应上的不同，可将铝诱导的根系有机酸分泌划分为两种模式，然而，关于Al是如何调控有机酸分泌的过程还有待进一步探明。此外，基于植物中富含氨基酸，含两个羧基并带有强负电荷的氨基酸如天门冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)及富含这些氨基酸的多肽和蛋白质理论上可以和Al3+相结合，降低Al3+的毒性。但迄今尚未发现拥有分泌这类多肽以提高抗铝性的植物或微生物。本研究一方面以模式Ⅱ(铝胁迫与有机酸的显著分泌间在时间上有明显的滞后期)植物饭豆为材料，研究铝调控有机酸分泌的关键因子：另一方面，通过人工合成多肽片段在酵母中表达，初步探讨其可行性，以明确氨基酸多肽片段在耐铝机制中的可能作用。结果概述如下： 1.调控饭豆根系铝胁迫下柠檬酸分泌的关键因子铝胁迫下饭豆根系可分泌柠檬酸来缓解铝毒，但在50μM铝胁迫下，柠檬酸的分泌至少滞后3小时，说明期间有一些铝诱导过程参与了与调控了柠檬酸的分泌。缺磷和与铝有类似毒性的镧均不能诱导柠檬酸的分泌，说明铝诱导的柠檬酸分泌具有专一性。50μM铝处理6小时后可显著增加根尖的柠檬酸含量以及柠檬酸分泌，但柠檬酸含量的增加明显早于柠檬酸分泌。几种质膜阴离子通道抑制剂，线粒体柠檬酸载体抑制剂以及一种蛋白质合成抑制剂，对铝诱导柠檬酸分泌的实验结果表明，阴离子通道抑制剂anthracene-9-carboxylicacid(A-9-C)和柠檬酸载体抑制剂phenylisothiocyanate(PI)均可显明抑制铝诱导的柠檬酸分泌；此外，A-9-C和PI处理均抑制了由铝脉冲处理诱导的柠檬酸分泌，两种抑制剂叠加处理更显著地抑制了柠檬酸的分泌，说明线粒体膜上的柠檬酸载体和细胞质膜上的阴离子通道对铝诱导的柠檬酸分泌起着同等重要的作用。蛋白质合成抑制剂Cycloheximide(CHM)也能明显抑制铝诱导的柠檬酸分泌，说明铝诱导的柠檬酸分泌过程需要有一些新蛋白质的合成。上述结果说明编码柠檬酸转运蛋白基因的诱导和激活(阴离子通道和载体)在铝调控饭豆根系柠檬酸分泌的过程中着十分重要的作用。 2.酵母表达人工设计的酸性多肽片段以提高抗铝性的初步研究一些生物化学和功能分析结果显示，酸性多肽，多聚L-天门冬氨酸，多聚L-谷氨酸，血清转铁蛋白可以和Al3+结合，由此推测富含L-天门冬氨酸和L-谷氨酸的多肽片段可与Al3+结合，如果植物或微生物可以大量分泌富含此类氨基酸的多肽片段，或许可以由此提高体外消除铝毒的能力，我们对此推测作了初步的实验研究。我们选择了一些不影响电荷的氨基酸作为间隔，设计了三种表达富含L-天门冬氨酸和L-谷氨酸的多肽的基因片段；采用受甲醇诱导的毕赤酵母表达系统，构建了表达载体，证实了酵母体内可表达多肽基因片段，合成预期的多肽。后续的抗铝性工作还有待于进一步验证。

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致谢

摘要

第一章文献综述

第二章调控饭豆根系铝胁迫下柠檬酸分泌的关键因子研究

第三章酵母表达人工设计的酸性多肽片段以提高抗铝性的初步研究

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