高氧肺损伤致纤维化机制及一氧化氮和亚硝酸乙酯吸入干预的研究

摘要

慢性肺疾病(chroniclungdisease，CLD)是一组由多种原因引起的肺部疾患，其主要的病理变化为肺发育障碍和肺间质纤维化。随着机械通气在儿科的广泛应用和极低体重儿存活率的提高，CLD的发生率也随之增加，已成为儿科的一个重要疾病。许多证据表明新生儿长期吸入高浓度氧引起以炎症和纤维化为主要特征的损伤，即高氧肺损伤，是致新生儿CLD的最主要危险因素。虽然许多研究试图从不同角度探讨高氧诱导新生儿肺损伤的发生、发展过程，但其确切的发生机制仍不清楚，目前也无有效的防治措施。因此，探讨高氧致CLD的发病机制已成为当今新生儿领域亟待解决并最具挑战性的研究课题之一，对其研究不仅有助于我们对本病的理解，还为本病的防治奠定基础。本课题以新生大鼠高氧肺损伤(95％氧暴露)的动物模型为基础，主要探讨高氧肺损伤致纤维化的可能机制和防治方法。 第一部分高氧肺损伤致纤维化机制的探讨一.目的1.探讨sonichedgehog(Shh)信号通路在高氧肺损伤致纤维化中的可能作用； 2.探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ和Ⅲ型胶原在高氧肺损伤致纤维化中的可能作用； 3.了解各种因子间相互作用，以及作为高氧肺损伤致纤维化指标的可能性。 二.方法1.模型建立和分组高氧组：将新生SD大鼠置于密封有机玻璃箱中，将氧气通入其中以维持Fi02＞0.95。 对照组：吸入Fi02为0.21(即空气)，具体方法及实验控制因素同实验组。均由母鼠喂养，两组每天交换一次，以避免因氧中毒而致其喂养能力下降。分别在处理后1、3、5、7和14天末，每个时间点处死8只大鼠，留取标本以备相关检查。 2.实验指标检测对可能参与高氧肺损伤纤维化的Shh、Gli1、Gli2、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、Ⅰ和Ⅲ型胶原进行mRNA和/或蛋白质水平检测，并应用免疫组化对部分指标进行定位检测。 肺组织病理学检查和透射电镜观察：取右下肺叶一块肺组织用4％多聚甲醛固定，组织切片用HE染色，做常规肺部病理学检查。部分新鲜用2.5％戊二醛固定，应用透射电镜观察超微结构。 RT-PCR检测：取100mg肺组织采用Trizol一步法提取总RNA，逆转录后应用自行设计引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳和基因凝胶成像系统半定量分析，用积分光度表示，取同内参(β-actin)ID的比值作为统计值。 WesternBlot检测：提取蛋白质，应用Bradford法测定蛋白浓度。取50～100μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，通过半干电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜上，封闭、结合一抗、二抗，最后以ECL放射自显影。用NIHScionImage软件半定量分析蛋白表达量。 免疫组化：新鲜组织4％多聚甲醛固定、切成4μm切片。严格按试剂盒要求进行，并设阳性和阴性及空白对照。 三.结果1.肺组织病理学检查高氧组新生大鼠大体解剖可见部分胸膜有渗出和淤点、淤斑。肺组织病理学检查发现高氧组新生大鼠有肺泡腔内渗出增多、炎症细胞浸润和肺泡间质增厚。 透射电子显微镜发现高氧组新生大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的板层体结构破坏，可见空泡。 2.Shh信号系统变化对照组内不同时间点ShhmRNA和蛋白质表达无差异(均P＞0.05)。高氧组大鼠的ShhmRNA和蛋白质随暴露时间延长呈逐渐上升趋势(均P＜0.05)，均在14天时达到高峰，高氧组不同时间点的ShhmRNA均高于对照组(均P＜0.05)，而蛋白质水平则从第5天末开始高于对照组(均P＜0.05)。免疫组化显示在高氧组大鼠Shh阳性明显较对照组强，高氧组支气管和肺泡上皮中Shh呈强阳性，尤以支气管上皮细胞染色明显，并且可见巨噬细胞、间质细胞及间质也有明显Shh表达。 对照组和高氧组均有Gli1和Gli2mRNA表达。对照组内不同时间点Gli1和Gli2mRNA水平无明显差异(均P＞0.05)，高氧组大鼠的Gli1mRNA在第3天始显著升高，第7天时达到高峰，此后又有所下降。除第1天末外，高氧组其它时间点Gli1mRNA均较对照组高(均P＜0.05)。高氧组大鼠的Gli2mRNA变化类似Gli1，不同的是Gli1mRNA在高氧暴露3天即较对照组明显升高，而Gli2mRNA在第5天才较对照组明显升高。 3.TGF-β1变化对照组内不同时间点TGF-β1mRNA和蛋白质水平均无明显差异(均P＞0.05)。高氧组的TGF-β1mRNA和蛋白质水平随暴露时间延长呈逐渐上升趋势，但其第1与3天间差异无显著性意义(均P＞0.05)。高氧组各时间点间TGF-β1mRNA水平均较对照组高(均P＜0.05)，而高氧组TGF-β1蛋白质从第5天开始高于对照组(均P＜0.05)。免疫组化显示对照组肺部少数巨噬细胞有TGF-β1表达，而高氧组大鼠的巨噬细胞、间质细胞和间质TGF-β1多呈阳性。 4.MMP-9、TIMP-1和MMP-9/TIMP-1变化对照组内不同时间点MMP-9和TIMP-1mRNA水平无差异(均P＞0.05)，高氧暴露早期，MMP-9和TIMP-1mRNA水平随暴露时间延长呈逐渐上升趋势，在第7天达到高峰后出现下降趋势。高氧组各时间点的MMP-9mRNA水平均较对照组高(均P＜0.05)；除第1天末外(P＞0.05)，对照组和高氧组其它时间点间TIMP-1mRNA差异均有显著性意义(均P＜0.05)。免疫组化显示对照组肺部仅少数MMP-9阳性细胞，高氧组的部分巨噬细胞、间质细胞及间质MMP-9呈阳性，也可见支气管和肺泡上皮中有MMP-9表达。对照组肺部TIMP-1阳性细胞也不多，高氧组大鼠可见部分巨噬细胞TIMP-1呈阳性对照组不同时间点MMP-9和TIMP-1比值(MMP-9/TIMP-1)差异无显著性意义(均P＞0.05)，高氧组不同时间点比值差异具有显著性意义(P＜0.05)，高氧组大鼠的1天末MMP-9/TIMP-1明显较其后各时间点高(均P＜0.05)。 5.Ⅰ和Ⅲ型胶原变化对照组内不同时间点间Ⅰ和Ⅲ型胶原mRNA差异无显著性意义(均P＞0.05)。高氧组内不同时间点Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白mRNA差异具有显著性意义(均P＜0.05)。两组间比较可见，高氧组在第3天末，其Ⅰ和Ⅲ型胶原mRNA就较对照组高(均P＜0.05)，并随暴露时间延长呈逐渐上升趋势。免疫组化显示对照组肺部有少数Ⅰ和Ⅲ型胶原阳性细胞。高氧组大鼠则有许多巨噬细胞、间质细胞及间质Ⅰ和Ⅲ型胶原呈阳性。 第二部分一氧化氮和亚硝酸乙酯吸入对高氧肺损伤的干预研究一.目的1.探讨一氧化氮吸入(iNO)和亚硝酸乙酯(ENO)吸入对实验性高氧肺损伤有无保护作用； 2.比较iNO和ENO吸入对实验性高氧肺损伤的干预作用； 3.了解iNO和ENO吸入对实验性大鼠肺部的可能毒性作用； 4.探讨ENO可能合理的治疗剂量和剂量—疗效关系。 二.方法1.ENO的合成常温环境下，在500ml三颈瓶中加入70g亚硝酸钠、63ml无水乙醇和40mlMilli-Q水制成饱和的亚硝酸钠乙醇溶液，然后用6mol/L硫酸缓慢滴定制得ENO气体，经冷凝后收集瓶中收集液态ENO。将制得的液态ENO置于干净三颈瓶中，室温下让其反复自由气化后重新冷凝，收集瓶中高纯度ENO溶液。所得ENO溶液-20℃保存待用。 2.动物模型的建立和分组新生SD大鼠分成8组，每组均32例。NO和ENO均在高氧吸入初第一个12小时吸入，此后停止。各组新生大鼠分别在处理1(24h)、3、7和14天处死。 (1)对照组(C组)：21％氧气(2)高氧组(O组)：95％氧气吸入(3)NO组：21％氧气+5ppmNO(4)ENO组：21％氧气+0.3％ENO(5ppm)(5)ONO组：95％氧气+5ppmNO(6)0.17ppmENO组：95％氧气+0.025％ENO(0.17ppm)(7)2ppmENO组：95％氧气+0.125％ENO(2ppm)(8)5ppmENO组：95％氧气+0.3％ENO(5ppm) 3.NO吸入将800ppmNO和压缩空气/氧气混合后通入密封的有机玻璃箱中，空气压缩机/氧气流量为10L/min，在入箱前10cm处通过检测仪持续监测NO和NO2浓度，调整NO流量使箱中NO浓度为5ppm，NO2浓度＜2ppm。NO+高氧干预组维持FiO2＞0.95。 4.ENO吸入把大鼠放入密封的有机玻璃箱中，将4％的ENO用无水乙醇稀释成上述3个浓度，每次取100毫升放在集气瓶中，置于零度的冰柜中，用0.6L/min的氮气吹入，吹出气体与10L/min压缩空气/氧气混合通入箱中。ENO+高氧干预组维持FiO2＞0.95。每两小时置换集气瓶中的液体以维持ENO浓度稳定。 5.检测指标和方法应用RT-PCR方法检测Shh、TGF-β1和Ⅰ型胶原的mRNA，具体方法同第一部分。

目录

缩略语

摘要

背景

第一部分高氧肺损伤致纤维化机制的探讨

前言

目的

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 一氧化氮和亚硝酸乙酯吸入对高氧肺损伤的干预研究

前言

目的

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

基质金属蛋白酶-9与肺部病理生理

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