维持耐辐射球菌基因组稳定性的关键基因recQ的功能及调控网络研究

摘要

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今为止发现的对电离辐射、紫外线、干燥、过氧化氢等一些DNA损伤剂都具有极强抗性的微小球菌，它在DNA双链断裂修复上具有超强的能力，是目前研究DNA损伤与修复的模式生物。从1999年Deinococcus radiodurans野生株R1全基因组数据公布以来，该细菌的分子结构特征研究，分子防御机制方面和重要修复基因，如recA、ssb、pprI,pprA等在DNA修复机制方面都取得了很大的进展，但还未能清楚揭示耐辐射球菌的修复机理。 RecQ解螺旋酶是解螺旋酶在进化中高度保守的一个亚族，它在维持有机体基因组的稳定性中有重要的作用。耐辐射球菌具有两个特殊结构的RecQ家族成员：DR1289和DR2444，这两个基因在该细菌中的具体功能都未知。本文主要系统地研究这两个基因在耐辐射球菌中的作用机制和调控网络，具体从以下几个方面进行了研究： 1．先运用生物信息学的方法确定这两个基因在染色体上的具体位置，对DR1289和DR2444进行了结构域的同源性分析，功能预测和进化树分析，结果表明DR1289与细菌及真核生物有较近的亲缘关系，而DR2444相差较远。 2．运用PCR突变三段连接法克隆具有自身groEL启动子、KAT启动子分别与卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因融合的DNA片段反向重组到基因组中，构建并鉴定了卡那霉素抗性完全突变株△DR1289，氯霉素抗性完全突变株△DR2444，双突变株△recO。辐射条件下和H<,2>O<,2>氧化压力下突变株生存率结果表明：△DR2444与R1存活率趋势线基本一致，而△DRl289和△recQ双突变株较为敏感。根据上述结果推测，DR1289是一个对R1保持极端抗性的必需基因，而DR2444是非必需基因。 3．分析了突变株△DR1289的一些特性，表型数据表明，敲除掉DR1289这个基因后，突变株对UV，丝裂霉素C，过氧化氢都极敏感，对γ-辐射在超过2 kGy剂量下敏感。△DR1289生长与野生株相比较为缓慢；脉冲场电泳表明，无论在正常生长状况，还是过氧化氢胁迫条件下，该突变株都具有基因组的不稳定性，尤其是在20 mM H<,2>O<,2>处理30分钟后，其基因组图谱与R1在高剂量辐射和长期干燥胁迫下的图谱很相似。运用穿梭质粒pRADK进行DR1289各个结构域的功能性补偿，表明helicase结构域和3个串联的HRDC结构域都必不可少。 4．用大肠杆菌表达系统体外表达了DR1289各个结构域的突变蛋白，并进行了纯化。我们使用荧光染料H33258，长度为2.7 kbp的线性化双链(HindⅢ-pUC19)片断作为底物的荧光染色替代法检测解螺旋酶活性。不同ATP和金属离子浓度下该蛋白的解螺旋酶活性表明，DR1289的解螺旋酶活性至少与曾经报道过的大肠杆菌的RecQ活性相当。SSB蛋白作为一个解螺旋酶功能促进因子，我们发现DRl289解螺旋速率能够被D.radiodurans SSB蛋白提高，且对DR1289蛋白有相同物种专一性的特殊效应。ATPase活性表明helicase结构域对DR1289 ATPase是必需的，而HRDC结构域是达到最适ATPase酶活性所必需的结构域。基于这些实验，我们推测在耐辐射球菌中，DRl289的C-末端三个串联的HRDC结构域已经进化，从而应对各种类型的DNA损伤。 5．在DR1289删除以后，全基因组转录谱水平约有9.1％发生了2倍以上的改变，如铁离子的代谢，氧化相关基因和细胞分裂相关基因。另外，在20mM H<,2>O<,2>压力下，突变株许多重要基因如recA，pprA，ddrA，DR0003，DR0070的转录水平变化趋势与野生株在强剂量辐射和长期干燥条件下的趋势很相象。Western blot分析表明无论在有氧化胁迫条件，还是在正常生长条件下，突变株中RecA水平都上升，表明当DR1289删除后，体内确实存在较大的DNA损伤，进一步佐证了芯片数据。高锰低铁可以促使耐辐射球菌的抗性提高，但ICP-MS测定结果显示DR1289突变体内全铁含量上升，而全锰含量下降，导致Mn/Fe比例从0.38下降到0.07。而顺磁共振实验表明突变株中的自由铁量约为野生株的50％。综上所述，DR1289基因是一个维持耐辐射球菌基因组稳定性和贡献于极端抗性的关键基因。 6．为了进一步研究耐辐射球菌DRl289蛋白在极端抗性中的调控机制，通过二维液相色谱ProteomeLab PF 2D目标蛋白快速分离系统分析了野生株R1与功能破坏株△DR1289在20 mM H<,2>O<,2>氧化压力下蛋白表达谱的差异。 综上所述，耐辐射球菌的两个recO基因中，DR2444是不参与极端抗性的非必需基因，而DR1289行使着多项重要的功能，体内活性、体外活性、转录谱表达和蛋白谱表达实验均表明它能够维持耐辐射球菌基因组的稳定性，保持细胞体内稳态性且和多个重要基因存在互作，是贡献于耐辐射球菌超强修复能力的关键基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

第一章文献综述

第一节耐辐射球菌极端抗性的研究进展

1.1耐辐射球菌的形态学特征

1.2耐辐射球菌的结构研究进展

1.3分子防御机制研究进展

1.4重要修复基因的研究进展

1.5基因组学的研究进展

1.6蛋白质组学的研究进展

1.7比较基因组学研究耐辐射球菌DNA损伤修复机制

1.8小结与展望

第二节解旋酶RecQ在维持基因组稳定性中的研究进展

2.1 RecQ解旋酶的分类和命名

2.2 RecQ解螺旋酶的结构特征和生化特性

2.3原核生物，以E.coli为例介绍RecQ解旋酶作用

2.4以酵母为例介绍真核生物RecQ解旋酶作用机制

2.5 RecQ解螺旋酶在人类疾病方面的研究综述

2.6小结

2.7关于耐辐射球菌RecQ的几点思考

参考文献

第二章耐辐射球菌recQ基因基于生物信息学方法的分析

1.引言

2.材料与方法

2.1材料

2.2方法

3.结果与分析

3.1 DR1289基因位置，核苷酸序列及氨基酸序列

3.2 DR1289的motif在线分析

3.3 DR2444基因位置，核苷酸序列及氨基酸序列

3.4 DR2444 Motif在线分析

3.5 DR1289各个结构域的同源性分析

3.6耐辐射球菌recQ同源物进化树分析

4.讨论

5.小结

6.参考文献

第三章耐辐射球菌recQ双突变株构建

1.引言

2.材料与方法

2.1菌株和试剂

2.2突变株的构建和转化

2.3突变株的鉴定

2.4辐射条件下突变株的生存率测定

2.5 H2O2氧化压力下突变株的生存率测定

3.结果和分析

3.1 RecQ双突变株的构建

3.2 RecQ双突变株的鉴定

3.3辐射条件下突变株存活率的测定

3.4突变株的H2O2生存率

4.讨论

5.小结

6.参考文献

第四章RecQ突变体特性及功能补偿活性分析

1.引言

2.材料与方法

2.1菌株与质粒

2.2生长曲线

2.3耐辐射球菌脉冲场电泳基因组制备流程

2.4耐辐射球菌脉冲场电泳(PFGE)流程

2.5补偿质粒及菌株的构建

2.6 MQ和MQ1-5的表型分析

2.7 DR1289蛋白兔多克隆抗血清的制备

2.8 Western blot印迹实验

2.9主要仪器

3.结果与分析

3.1 △DR1289突变株对各种逆境的生存率曲线分析

3.2△DR1289生长较为缓慢

3.3脉冲场电泳分析表明△DR1289具有基因组的不稳定性

3.4补偿质粒可在体内稳定表达各个结构域

3.5功能补偿实验表明三个HRDC结构域都贡献于极端抗性

4.讨论

5.小结

6.参考文献

第五章耐辐射球菌RecQ蛋白的体外活性研究

1.引言

2.材料与方法

2.1菌株与质粒

2.2实验材料与试剂

2.3菌株培养

2.4 DR1289蛋白表达质粒和突变蛋白表达质粒的构建

2.5 DR1289蛋白和突变蛋白的表达

2.6 DR1289蛋白和突变蛋白的纯化

2.7解螺旋酶(Helicase)活性测试

2.8 ATPase活性测试实验

2.9仪器与设备

3.结果与分析

3.1 DR1289蛋白表达质粒的构建及蛋白纯化

3.2 DR1289解螺旋酶活性

3.3 HRDC结构域截短后对DR1289各突变蛋白的效应

3.4 D.radiodurans SSB蛋白对DR1289解螺旋酶活性的效应

3.5 HRDC结构域能够提高DR1289的ATPase酶活性

4.讨论

5.小结

6.参考文献

第六章耐辐射球菌recQ突变体基因表达谱差异分析

1.引言

2.材料与方法

2.1芯片的设计与制备

2.2 RNA的提取和纯化

2.3芯片杂交流程

2.4芯片所需试剂及保存条件

2.5荧光实时定量PCR

2.6 Western Blot分析RecA的表达

2.7细胞体内全Fe和全Mn含量的测定

2.8电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance,EPR）测定细胞内自由铁

3.结果与分析

3.1 △DR1289突变体转录谱水平分析

3.2氧化压力下△DR1289突变株与R1转录谱水平比较

3.3荧光定量PCR验证芯片数据

3.4 △DR1289突变体RecA蛋白的Western Blot分析

3.5 △DR1289突变体内Mn/Fe和自由铁含量变化

4.讨论

5.小结

6.参考文献

第七章耐辐射球菌recQ突变株蛋白谱表达差异

1.引言

2.材料与方法

2.1仪器与试剂

2.2样品制备与试剂准备

2.3细胞样品的裂解处理步骤

2.4蛋白质的二维液相色谱分离

2.5蛋白质组图谱分析软件

3.结果与分析

3.1耐辐射球菌各样品的第1维图谱差异

3.2耐辐射球菌各样品的第2维图谱差异

3.3标的蛋白的胰酶酶解与质谱分析

4.讨论

5.小结

6.参考文献

结论

博士期间发表论文(含待发表)

致谢