棉花遗传转化方法与耐盐、抗除草剂基因的转化利用研究

摘要

棉花是一种重要的经济作物，基因工程技术对于提高棉花的产量、增强抗逆能力和改良纤维品质具有重要的作用。目前用于棉花的转基因系统主要有载体转化系统、DNA直接导入系统和种质转化系统等。种质转化系统(germ line transfornlation)是利用植物自身的生殖过程转化外源基因，无需经过组培而直接得到转化种子。本文结合农杆菌介导法和花粉管通道法的优点，创建了一种花粉转介外源基因转化的新方法一花粉粒农杆菌转染法，并与棉花的其它转化方法一子房注射质粒DNA、农杆菌介导柱头点滴法和顶端分生组织农杆菌介导法等进行了分析比较，对四种方法的转化效率和转基因植株的遗传特性进行研究；同时，利用获得的转bar基因抗除草剂棉花种质系为亲本进行杂种优势利用及杂种纯度控制的研究，创建出一套可控制田间纯度的杂交棉制种新技术。此外，本研究还通过花粉管通道法将山菠菜BADH基因和拟南芥的AtNHX1基因导入棉花，创造耐盐能力得到较大提高的转基因耐盐棉花种质材料。主要研究结果如下： 1．棉花花粉粒农杆菌转染技术的研制 花粉农杆菌感染法是通过农杆菌和花粉共培养，再利用自身的花粉管授粉途径转化外源基因的一种新的棉花遗传转化方法。将携带有目的基因质粒pCB4的农杆菌菌株LBA4404与陆地棉新鲜花粉粒共培养丁花粉萌发培养基中进行转染，质粒载体pCB4中包括标记基因barr，CaMV 35S启动子及NOS终止子。通过除草剂Basta抗性鉴定，PCR及Southem杂交检测，验证了bar基因的整合和表达。并对转基因棉种质的外源基因遗传特点和对农艺和经济性状的影响进行了研究。结果表明，该方法的转化率达5.5％，显著高丁花粉管通道法。分子检测和遗传分析结果表明，外源基因在转基因植株中均为单拷贝，符合典型的孟德尔分离规律，外源基因的整合对于转基因棉的农艺性状和经济性状无显著的影响，是一种具有较好利用价值的棉花外源基因转化方法。 2．棉花外源基因转化方法的比较 采用包括本研究建立的棉花农杆菌花粉粒介导技术在内的多种外源基因转化方法，用携带有基因bar的质粒pCB4的农杆菌菌株LBA4404转化陆地棉“Coker312”，评价各方法的转化效果和外源基因的遗传特点。结果表明，子房注射质粒DNA(方法Ⅰ，普通的花粉管通道法)、花粉粒农杆菌转染法(方法Ⅱ)、农杆菌介导柱头点滴法(方法Ⅲ)和顶端分生组织农杆菌介导法(方法Ⅳ)均获得了具有外源基因表达的转化植株。叶片除草剂Basta抗性鉴定、PCR检测和Southern杂交证实了bar基因已经整合剑植物基因组中。然而，各种方法的转化率、所需要的转化时间以及方法的可重复性和操作简易性各有差异。同其他三种方法相比，方法Ⅱ是一种比较经济和技术可行的转化方法。它所需要的转化时间与方法Ⅰ大致相同，而可重复性接近丁方法Ⅳ。另外，方法Ⅱ操作简单经济，无需昂贵的仪器，无需经过方法Ⅳ所要的组织培养。研究结果还表明，虽然方法Ⅳ转化效率比较高，但得到的转基因植株却低于方法Ⅱ，且转基因植株的生长发育受到一定的影响。从各种参考表现米看，方法Ⅲ是所有转化方法中最不可取的方法。 3．转BADH和AtNHX1耐盐转基因棉花研究 通过花粉管通道法将山菠菜BAOH基因和拟南芥的AtNHX1基因导入陆地棉品种中棉所35。PCR检测和Southern杂交证明，BADH和AtNHX1基因已经整合剑转基因棉花的基因组中，共获得了5株转BADH基因和9株转AtNHX1基因的转化棉株。盐池抗性鉴定结果表明，转BADH基因棉和转AtNHX1基因棉在含有0.8％NaCI的人工盐池中的发芽率分别为63.4％和82.4％，显著高于末转外源基因的亲本对照(2.4％)。尽管本研究末能对转基因植株中后期的耐盐性进行深入的鉴定和研究，但初步结果表明，转基因植株具有较好的苗期耐盐特性，具有重要的利用价值。 4．抗除草剂转基因亲本杂种优势和杂种纯度利用 以本研究获得的转bar基因抗除草剂棉花种质系BR001为父本，与不同米源的转基因抗虫棉进行杂交，获得7个转基因抗虫、抗除草剂杂交棉组合。以推广的抗虫杂交棉中棉所29为对照，研究抗虫抗除草剂杂交棉的产量、纤维品质、农艺性状和杂种优势表现，结果表明。7个组合的皮棉产量均表现为显并的超高亲优势，其中6个组台的皮棉产量表现为正向的竞争优贽，且纤维品质平和农艺性状优良，加上其带有抗除草剂特性，可进行田间化学除草，显著降低植棉成本。因此，抗虫、抗除草剂杂交棉具有较好的生产应用前景。由于杂交棉父本的抗除草剂性状是一显性性状，F<,1>仍具有抗除草剂特性，对杂种F<,1>棉苗喷施除草剂，在防治田问杂草的同时，可自动清除混杂其中的假杂种，确保杂交棉的纯度。本研究用标记性状(色素腺体)对该技术体系进行验证。结果表明，该杂交棉纯度控制技术具有准确、快速、经济、高效等特点，对于杂交棉生产具有重要的利用价值。此外，以本研究建立的杂交棉纯度控制技术为基础，本研究较客观地评价了杂交棉市场的种子纯度现状，并研究了不同杂交棉纯度对于产量和纤维品质的影响。结果表明，当杂交棉纯度低丁二90％时，其产量和纤维品质显著降低，提高种子的纯度可显著的提高杂交棉的产量和纤维品质。这一结果说明本研究建立的杂交棉纯度控制技术对于提高杂交棉产量和改善杂交棉纤维品质的意义。

目录

论文说明：缩略词表

致谢

摘要

第一章文献综述

1.1棉花基因工程与基因转化研究进展

1.1.1棉花的遗传转化方法

1.1.2棉花遗传转化的主要成就

1.1.3棉花抗除草剂基因工程及其应用

1.1.4转基因棉花外源基因的遗传与表达

1.1.5棉花基因转化存在的问题

1.2棉花耐盐性机理和遗传改良研究进展

1.2.1棉花的耐盐性

1.2.2棉花的耐盐机理

1.2.3棉花耐盐品种的改良

1.3本论文研究内容及目的意义

第二章棉花转基因方法的改良及其转化效率效果的研究

2.1材料和方法

2.1.1农杆菌菌株和受体材料

2.1.2生化试剂

2.1.3培养基

2.1.4转化方法

2.1.5转基因棉苗的筛选和鉴定

2.1.6 PCR检测

2.1.7 Southern杂交检测

2.1.8农杆菌残留检测

2.1.9转基因植株农艺性状与抗性遗传

2.2结果与分析

2.2.1 Basta涂抹鉴定的可靠性评价

2.2.2四种转化方法的改良效果研究

2.2.3转基因植株抗Basta性状的遗传分析

2.2.4转Bar基因棉花农艺性状和纤维品质分析

2.3讨论

第三章棉花BADH和AtNHX1基因的遗传转化及其耐盐性研究

3.1材料与方法

3.1.1受体棉花品种

3.1.2菌株和载体质粒

3.1.3相关试剂

3.1.4试验方法

3.1.5转基因棉花的初步筛选

3.1.6转基因棉花的分子检测

3.1.7转基因棉花外源基因遗传分析

3.1.8转基因棉花耐盐性及其农艺性状鉴定

3.2结果与分析

3.2.1 BADH和AtNHX1基因子房注射效果

3.2.2转基因棉花植株的筛选与鉴定

3.2.3转BADH和AtNHX1基因棉花的耐盐性鉴定

3.2.4转BADH基因棉花的外源基因遗传分析

3.2.5转BADH和AtNHX1基因棉花的农艺性状和纤维品质

3.3讨论

第四章转Bar基因种质系在杂交棉纯度控制中的利用

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1抗除草剂杂交组合的杂种优势表现

4.2.2田间抗性鉴定除草剂浓度筛选

4.2.3转Bar基因棉花在杂交棉纯度鉴定和纯度控制中的应用

4.2.4不同来源的杂交棉种子纯度鉴定

4.2.5种子纯度与产量表现

4.2.6棉种纯度与纤维品质表现

4.3讨论

4.3.1利用抗除草剂基因进行田间控制杂交棉纯度

4.3.2转Bar基因对F1代杂种群体性状和杂种优势的影响

4.4.3转Bar基因作物的安全性问题

第五章全文小结

参考文献