肿瘤坏死因子1型受体在小鼠后肢缺血模型中的双重作用

摘要

外周动脉病是一种进展性的疾病,其发病率随年龄增长而升高,60岁以上男性约为16﹪,女性则为13﹪.约25﹪患者最终需血运重建治疗,5﹪患者发展为重度下肢缺血.而这些重度下肢缺血患者目前治疗手段有限,部分患者最终因为严重缺血导致截肢,而截肢后预后并不佳.外周动脉闭塞常发生于动脉粥样硬化基础之上,治疗不及时将导致肢体坏死甚至丧失生命.栓塞和血栓形成是外周动脉急性闭塞的两个主要原因,目前主要的治疗方法是外科手术和溶栓治疗.外科手术虽然是经典的治疗金标准,但由于相关并发症其30天死亡率高达15﹪～20﹪,因而仍有待改进.近年来的前瞻性随即对照临床研究表明溶栓治疗作为初始疗法可降低随后外科手术风险,提高肢体存活率,但是出血并发症并不少见,颅内出血发生率为1～2﹪.此外部分慢性重度下肢缺血并不适合外科手术和溶栓治疗,而急性外周动脉闭塞用外科手术和溶栓治疗开通动脉的同时也应设法减少肢体死亡,因此有必要探索新的治疗方法. 人体中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)合成后以26kDa的前体多肽结合于细胞膜上,在TNF转换酶催化下裂解为17kDa可溶性TNF单体,最终形成有活性的同型三聚体.TNF升高在充血性心力衰竭、急性心肌梗死和脑缺血中起着不良作用.TNF主要通过肿瘤坏死因子l型受体(tumor necrosis factorreceptor 1,TNFR-1,又名P55)和TNFR-2(又名P75)两个受体起作用,与TNFR-1结合后可通过激活caspase促进细胞凋亡,也可通过NFκB而促进细胞生存.大多数急性心肌梗死或心肌病的动物研究发现TNF的不良作用可能由TNFR-1介导.Tuo~sto等的研究表明急性下肢缺血患者骨骼肌TNF信号通路表达上调,升高倍数分别为TNF(3.7倍)、TNF转换酶(15.3倍)、TNFR-1(2.9倍).但是这种上调和组织缺血坏死间有没有直接的因果关系还不明确,目前未见相关报道. 实验目的:本研究以肿瘤坏死因子1型受体敲除小鼠(TNFR-1<'-/->)和野生型小鼠(WT)为实验对象,观察TNFR-1在小鼠急性后肢缺血中对组织坏死的作用,以及在随后恢复期中对血管新生的效应. 实验方法: C57BL/6 WT和C57BL/6 TNFR-1<'-/->小鼠经4﹪水合氯醛腹腔注射麻醉,结扎左侧股动静脉近端、远端及其主要分支,右侧股动脉为假手术处理,仅分离股动静脉而不结扎.为标记新生的血管内皮细胞,术后3天起动物每天1次腹腔注射BrdU(50 mg/kg体重)直至处死.术后1周对后肢缺血损伤进行半定量评估(0分:没有改变;1分:轻度肤色改变;2分:中到重度肤色改变;3分:坏死;4分:自发截肢).术后1、3、7、14和21天动物用4﹪水合氯醛麻醉后用激光多普勒灌注成像系统测量双侧后肢血流灌注值,然后两组各处死7只动物,取等量内收肌提取蛋白,取腓肠肌置于O.C.Z复合物中后制成厚8岬的冰冻切片,标本立即保存于-80℃冰箱中.术后2天两组同法处死3只动物,取等量内收肌提取DNA,电泳检测细胞凋亡DNA片段.使用TUNEL染色观察缺血后1天腓肠肌组织细胞凋亡情况,Hoechst 33342染细胞核以计数总细胞.术后1天内收肌蛋白标本Western blot测定Caspase-3、Bax蛋白的表达.术后21天腓肠肌标本免疫组化染色CD31和BrdU,CD31标记的为血管内皮细胞,CD31和BrdU共标记的为新生血管的内皮细胞.为探讨TNFR-1敲除对缺血后血管新生的影响机制,非缺血对照小鼠及缺血后1、3、7、14、21天两组小鼠内收肌蛋白标本经Western blot测定血管形成素受体Tie-2、血管形成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)、血管形成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,,VEGF)表达改变. 实验结果: 术后1、3、7天.TNFR-1<'-/->组缺血后肢血流灌注值显著高于WT组,术后1天腓肠肌切片TUNEL阳性细胞数显著低于WT组.TNFR-1<'-/->组缺血评分也显著低于WT组,相应地两组的自发截肢率分别为0﹪、50﹪.TNFR-1<'-/->组DNA凋亡梯带、Caspase-3和Bax蛋白表达减弱,表明敲除TNFR-1可以减少细胞凋亡.然而从术后14天起,两组间的缺血后肢血流灌注值差别无统计学显著意义.术后21天CD31免疫荧光染色提示两组间血管内皮细胞总数相似,但CD31和BrdU共标记的新生血管内皮细胞数TNFR-1<'-/->组显著低于WT组,提示TNFR-1<'-/->小鼠缺血后血管新生活动受损.与WT小鼠相比,Western blot提示TNFR-1<'-/->小鼠Ang-1及其受体Tie-2表达下调. 实验结论: 1.TNFR-1敲除可抑制TNF信号通路下游死亡相关蛋白的激活,减少细胞死亡和凋亡,显著降低缺血后自发截肢的发生率,对急性后肢缺血有保护作用.2.TNFR-1是后肢缺血后的血管新生活动重要参与者,缺乏TNFR-1抑制了缺血后血管新生活动,其下游介导机制为Ang-1和Tie-2信号通路.

目录

摘要

前言

材料和方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述 肿瘤坏死因子与心血管疾病

博士在读期间发表论文一览表及所获奖励

致 谢