HepLL细胞海藻酸-壳聚糖微囊包裹和冻存研究

摘要

获得足够数量具有高度活性及良好功能的肝细胞是生物人工肝(Bioarfificialljver-BAL)发挥功能和肝细胞移植(Hepatocyte transplantation,HCT)获得成功的关键.众所周知,正常人肝细胞来源有限,且在宿主体内增殖较弱;而胎肝细胞、肿瘤源性肝细胞由于致瘤性风险和伦理学原因,也难以在临床推广应用.为此本实验室已经通过SV40LTag转染正常成人原位肝移植的供肝细胞,建立了一株永生化人源性肝细胞HepLL,在体外可以无限传代.一系列鉴定结果表明它具有和人原代培养肝细胞类似的形态学特征,保持了大部分正常肝细胞的生物学活性.将该永生化HepLL肝细胞进行BALB/C裸鼠移植的实验结果表明,脾内移植的HcpLL细胞参与和促进了部分肝切除裸鼠的肝脏再生.前期的工作证实HepLL细胞可在体内外发挥良好的特异性肝细胞功能,有应用于生物人工肝和肝细胞移植的前景;但必须解决体外大规模培养和保存运输等问题.普通的单层贴壁培养为二维平面培养,限制了大规模的扩增和长时间细胞功能的发挥,且其冻存和收获用于生物人工肝和肝细胞移植较为复杂困难.微囊培养为三维空间培养,是进行大规模扩增的良好手段,也是建立生物人工肝和肝细胞移植所需肝细胞库的潜在培养方法,同时为大规模冻存和运输提供了便捷的手段.因此,本实验进行了HepLL细胞海藻酸一壳聚糖(AC)微囊包裹和短期培养的研究,并对AC微囊化HepLL细胞的冻存保护液配方进行了初步的探索. 方法: 1.一步法和两步法海藻酸-壳聚糖(AC)微囊包裹HepLL细胞,MTT法检测包裹后7天两者的活力,以确定适合HepLL细胞AC包裹的方法. 2. 以单层贴壁的HepLL细胞为对照组,每天以MTT、Ki-67免疫组化染色检测一步法AC微囊包裹HepLL细胞活力和增殖活性,激光共聚焦显微镜、HE染色观察其形态学特征至第10天;以两天为间隔检测其白蛋白、尿素合成、安定转化等肝细胞特异性功能至第10天,评价AC微囊包裹HepLL细胞能否在微囊内发挥良好的生物学活性. 3.分别用含海藻糖的冻存保护液和不含海藻糖的冻存保护液冻存一步法AC微囊包裹后6天的HepLL细胞,-80℃冻存14天后复苏,MTT法检测其复苏后当天、第7天的增殖活性,检测复苏后第7天白蛋白合成能力和安定转化能力,以探索AC微囊化HepLL细胞冻存液的较佳配方. 结果: 1.一步法海藻酸-壳聚糖(AC)包裹后7天的HepLL细胞比两步法包裹的活力更强; 2. 一步法AC微囊包裹的HepLL细胞在微囊内能存活并均匀分布,至第10天细胞增殖标记Ki-67表达仍较强;和单层贴壁的细胞相比一步法AC微囊包裹的HepLL细胞包裹后8天至10天,其活力、合成能力、和生物转化能力更强; 3.复苏后当天、第7天,海藻糖组微囊化HepLL细胞活力比对照组微囊化HepLL细胞更强,复苏后第7天其白蛋白合成能力比对照组强.以上结果显示一步法AC微囊包裹的HepLL细胞能在微囊内存活、增殖,和单层贴壁的相比,较长时间培养活力更高、功能更强,是潜在的应用于生物人工肝和肝细胞移植的良好细胞培养方式;应用了海藻糖的冻存保护液能较有效地保护冻存微囊化HepLL细胞的功能. 本研究为进一步建立体外HepLL细胞大规模培养、冻存、运输体系和生物人工肝、肝细胞移植用肝细胞库提供了实验基础.

目录

摘要

第一部分AC法包裹HepLL细胞和短期培养

前言

材料和方法

第一节一步法和两步法AC微囊包裹HepLL细胞

第二节一步法AC微囊包裹HepLL细胞和短期培养

1实验设计

2实验方法

3结果

4讨论

5小结

第二部分海藻糖作为AC微囊化HepLL细胞冻存保护剂的初步研究

参考文献

综述微囊化肝细胞研究进展

一、前言

二、肝细胞微囊制备的原理与方法

三、肝细胞微囊化材料和包囊方法

四、微囊化肝细胞的选择和功能的发挥

五、微囊化肝细胞的冻存

六、问题与展望

参考文献

英文缩写一览表

在读期间发表的文章、获得的专利和奖项

致谢