基于纸片保存奶样的奶牛隐性乳腺炎诊断技术研究

摘要

本文从奶牛隐性乳腺炎的流行病学、影响纸片保存奶样中乳糖、乳蛋白等生化指标测定的因素、纸片保存奶样中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的PCR检测方法及其适用性进行了探索、最后对牛奶蛋白的SDS-PAGE电泳在隐性乳腺炎诊断的应用作了探讨，并对各种方法与标准诊断方法进行了比较分析。 对杭州等地4388份奶样体细胞计数值与季节、奶产量、泌乳周期、乳脂和脂蛋白等因素的关系进行了调查，利用限制性最大似然估计(REML)模型进行了分析，结果表明采样月份(F=8.83，p<0.01)、日奶产量(F=212.12，p<0.01)、胎次(F=16.86，p<0.01)、乳脂率(F=71.87，p<0.01)、乳蛋白(F=78.92，p<0.01)等因素对奶样体细胞数均有显著影响。利用混合线性模型的最大似然估计(REML)方法建立了体细胞计数响应模型，该模型可以有效地预测体细胞数的变化规律。在此基础上利用Logistic回归模型分析了采样月份、胎次、泌乳周期和日产奶量等因素对隐性乳腺炎发病率的影响程度，建立了相应的预测模型，经共线性检验，模型预测值与原始数据吻合良好(p>0.05)模型分析提示，每年的8-9月份体细胞水平显著升高(p<0.05)。日产奶量在20-30 kg，乳脂率在3.5-5.0％，蛋白含量在2.5-3.1％时奶牛隐性乳腺炎发病机率最低。 纸片保存奶样中乳糖含量的变异系数略大于液态奶样，但乳糖水平无显著差异(t=0.389，p>0.05)。保存期(F=1.004，p>0.05)、保存温度(F=0.004，p>0.05)对纸片保存奶样的乳糖水平没有显著影响，其乳糖含量仅受奶样本身体细胞数的影响(F=162.42，p<0.01)。提示纸片保存奶样适用于进行牛奶乳糖指标的测定。 纸片保存奶样的蛋白含量约为液态奶样的83.6％，其变异系数为4.41％。保存时间和预处理介质对纸片保存奶样蛋白含量有显著影响(p<0.01)，并受牛奶体细胞数的影响(p<0.05)。保存温度对其影响不显著(p<0.052)。保存时间和预处理介质对纸片保存奶样的蛋白水平有协同影响(p<0.01)。初始值和保存1、2、4周的样品间均有统计学显著差异(p<0.05)；随着时间的延长，样品中蛋白含量逐渐下降，DDW、Tris盐酸缓冲液预处理对纸片保存奶样蛋白水平均有显著影响，EDTA对测定结果没有显著影响(p<0.05)。提示纸片保存奶样蛋白质含量稍有下降，但在1-4周内可以保持相对稳定。 对人工污染无乳链球菌的纸片奶样进行复苏培养，结果表明，纸片预处理介质(p<0.01)和保存期(p<0.01)对纸片保存无乳链球菌复苏率有显著影响，而保存温度对结果的影响较小(p>0.05)。纸片保存温度(p<0.05)、预处理方法(p<0.01)和保存期(p<0.01)对金黄色葡萄球菌的培养成功率有显著影响。 针对无乳链球菌16-23S rRNA基因间区序列的引物，可扩增出唯一的270bp的PCR产物，而对人工污染的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的液态奶和纸片保存样品均无扩增产物形成。该引物对无乳链球菌的PCR检测灵敏度为2×10<'2>cfu/ml，与液态奶的检出结果相似。预处理方法对PCR结果没有显著影响，所有处理均可获得满意的PCR结果。以细菌培养为参照，PCR诊断的敏感性为96.15％，特异性为98.60％，准确率为98.06％，可以有效地从纸片保存样品中检出无乳链球菌。 金黄色葡萄球菌引物SAISR1和sAISR2可分别从纸片保存样品中扩增出约500bp和250bp的特异性PCR产物，而对人工污染无乳链球菌等奶牛隐性乳腺炎主要病原无特异性扩增。SAISR1和SAISR2对纸片样品的检测灵敏度分别为2×10<'4>CFU/mL和2×10<'3>CFU/mL；若采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合硝酸银染色，SAISR2的灵敏度可提高至2×10<'1>CFU/mL。纸片预处理介质对PCR结果没有显著影响。以细菌为标准，SAISR2的灵敏度为89.19％，特异性为98.08％，诊断准确率96.37％，可有效地从纸片保存奶样中检出金黄色葡萄球菌。 利用SDS-PAGE研究了纸片保存奶样乳蛋白成分变化，分子量较小的成分得到较好的分离(R<,f>>0.2)，呈现为独立的条带群。分子量较大的成分滞留在上样孔附近，迁移率很小(R<,f><0.2)。迁移率较大的成分主要形成R<,f>值在0.51(A)，0.62(B)，0.72(C)，0.78(D)，0.84(E)和0.98(F)等6个条带群，其中C、D和E三个条带群，可因奶样不同而呈现不同的亮度或缺少，经与HMT、SCC和主要病原菌分离培养等试验结果联合分析，C、D、E三个条带群与SCC(r=0.795，p<0.01)、HMT(r=0.471，p<0.01)和主要病原菌的存在(r=0.389，p<0.01)有显著相关。 与细菌分离培养对比，SDS-PAGE方法对隐性乳腺炎诊断的灵敏度为100％，特异性为55.56％，若将分离到凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)也计入病原菌，则SDS-PAGE的灵敏度为90％，特异性为70.59％，与细菌培养的结果高度一致(kappa=0.622，p<0.05)，PAGE方法比常用的HMT方法具有更好的灵敏度和特异性。与SCC法相当。 综上所述，纸片保存奶样的隐性乳腺炎诊断可以采用乳糖、蛋白成分分析和PCR检测等方法进行，其中以PCR方法的特异性较高，而以蛋白质成分分析的灵敏度最高。

目录

论文说明：图表目录

摘要

第一部分文献综述

第一章前言

1奶牛隐性乳腺炎

2奶牛隐性乳腺炎的诊断方法

3研究内容和总体思路

第二章奶牛隐性乳腺炎病原学研究进展

1金黄葡萄球菌毒素研究进展

2 B群链球菌毒素研究进展

3金黄色葡萄分子流行病学检测研究进展

4无乳链球菌分子流行病学检测研究进展

第三章奶牛隐性乳腺炎对乳成份的影响

1牛奶体细胞数在隐性乳腺炎诊断中阈值的确定

2隐性乳腺炎对牛奶中酶活性的影响

3牛奶电导率的改变

4急性时相反应蛋白

5炎症的其它指标

第二部分研究内容

第四章奶牛隐性乳腺炎的流行病学调查

1材料与方法

2结果

3.讨论

第五章保存温度及保存期对纸片保存奶样乳糖含量的影响

1材料与方法

2结论

3讨论

第六章保存温度、保存期及纸片预处理介质对纸片保存奶样蛋白含量的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

第七章纸片保存奶样中无乳链球菌的PGR检测方法研究

1材料与方法

2结果

3讨论

第八章纸片保存奶样中金黄色葡萄球菌的PCR检测研究

1材料与方法

2结果

3 讨论

第九章纸片保存奶样蛋白聚丙酰酰胺凝胶电泳在奶牛隐性乳腺炎诊断中的应用

1材料与方法

2结果

3讨论

第十章结论与创新点

1结论

2创新点

参考文献

附录

致谢