丙酯草醚的AHAS作用靶标及微粒体代谢研究

摘要

2-嘧啶氧基-N-芳基苄胺类衍生物是我国拥有自主知识产权、自行创制的一类具高效除草活性的农药先导化合物，具有国际原创性。丙酯草醚是该类化合物中已成功开发的一种新型高效油菜田除草剂。目前，国内外有关丙酯草醚的除草形式及其对作用靶标的抑制作用、除草选择性的代谢基础等尚缺乏必要的研究。明确丙酯草醚除草形式对作用靶标的抑制作用，阐明丙酯草醚在植物体内的代谢途径，尤其是其增、脱毒途径，对于明确其除草作用机理至关重要。 本文旨在研究丙酯草醚及其可能的代谢产物对AHAS的抑制作用及其在微粒体中的代谢作用。主要研究结果如下： 1、以油菜叶片和子叶为试材，对乙酰乳酸合酶(AHAS)部分纯化及活性测定的条件进行了优化。通过不同饱和浓度硫酸铵(25％-50％，5％-15％-40％，15％-40％)及PEG(W/W，5％-15％)分级沉淀AHAS并比较不同反应时间的酶活力大小，确定以下酶部分纯化与测定条件能得到较高的酶比活力，且步骤相对简单：硫酸铵饱和浓度15.40％分级沉淀，酶促反应时间为30min，反应温度37℃。 由于分离过程中酶活力损失较大，试图通过梯度离心法分离叶绿体来进一步纯化AHAS的效果并不理想。 2、支链氨基酸的负反馈调节作用是植物AHAS的特征，在多次提取不同植物材料AHAS过程中注意到，三种支链氨基酸对AHAS酶活力的抑制作用根部的总是小于来自叶片的酶，这与早期文献报道的植物中存在负反馈抑制差异很大的AHAS同工酶相一致，由此推测根部AHAS可能代表一种对支链氨基酸不敏感的AHAS同工酶。第二种可能是在提取过程中可能发生了酶蛋白的部分降解，改变了酶对支链氨基酸的敏感性，或者是AHAS(粗)酶测定中有其它干扰因子。针对第二种可能性，我们通过加入蛋白酶抑制剂DPDS对提取过程中酶活性及其负反馈抑制的变化情况进行了分析。初步结论是蛋白水解不是造成根叶来源AHAS负反馈差异的主要原因，根部存在对支链氨基酸不敏感的丙酮酸脱羧酶干扰了AHAS酶活性可能是其主要原因。 3、以油菜和玉米叶片为试材，研究丙酯草醚及其推测代谢产物对AHAS的抑制作用。具有“嘧啶-氧-苯”母核结构的嘧啶水杨酸类化合物A能强烈抑制酶活性，其余包括丙酯草醚及其重排产物在内的7种化合物均无效。这与报道的丙酯草醚为前体除草剂的结果一致，但丙酯草醚在植物体内是否先转化成嘧啶水杨酸类化合物再发挥其除草作用有待于进一步研究。 4、通过根长实验法，研究10个小麦品种对丙酯草醚的敏感性。在20μm丙酯草醚的作用下，By535受到的抑制作用最明显，达到了62.4％(扣除溶剂影响)；抑制率最低的为临麦2号和泰山23＃，分别为38.7％、40.7％(扣除溶剂影响)。 5、从经5％乙醇和10mM丙酯草醚诱导的小麦黄化苗地上部制备微粒体，研究[c环-u-<'14>C]丙酯草醚在小麦微粒体中的代谢作用。HPLC-MS鉴定了3种标记产物的分子结构，获知丙酯草醚在小麦微粒体的作用下进行了芳环的羟基化作用，微粒体反应体系也可能有助于丙酯草醚的异构化，在微粒体中丙酯草醚的代谢可能与Smiles重排反应有关。但丙酯草醚在植物细胞内是否容易转化成重排系列化合物以及这些代谢物与丙酯草醚的除草活性或者脱毒的相关性尚待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

致谢

第1章文献综述

1.1乙酰羟酸合酶(AHAS)

1.1.1支链氨基酸生物合成途径

1.1.2 AHAS催化反应机制与动力学特征

1.1.3 AHAS的结构

1.1.4抗性杂草AHAS的突变

1.2 AHAS靶标除草剂

1.2.1磺酰脲类除草剂

1.2.2咪唑啉酮类除草剂

1.2.3嘧啶水杨酸类除草剂

1.3除草剂选择性代谢基础

1.3.1谷胱甘肽转移酶与除草剂代谢

1.3.2 CytP450酶系与除草剂代谢

1.4新型油菜田除草剂丙酯草醚的创制研究现状

第2章AHAS的部分纯化与活性测定

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2仪器与试剂

2.1.3缓冲溶液与Percoll不连续梯度配制

2.1.4乙酰羟酸合酶的提取

2.1.5乙酰羟酸合酶的活性测定

2.1.6硫酸铵分级沉淀与PEG法提取AHAS比较

2.1.7叶绿体提取与AHAS部分纯化

2.1.8支链氨基酸对AHAS的负反馈抑制作用

2.1.9蛋白酶抑制剂DPDS对AHAS酶活力的影响

2.2结果与分析

2.2.1硫酸铵分级沉淀浓度的选择

2.2.2 PEG与硫酸铵分级沉淀提取AHAS的比较

2.2.3酶反应时间的选择

2.2.4梯度离心分离叶绿体法部分纯化AHAS

2.2.5支链氨基酸对AHAS的负反馈抑制

2.2.6蛋白酶抑制剂DPDS对AHAS活力的影响

2.3小结

第3章丙酯草醚及可能代谢产物对AHAS的抑制作用研究

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2试剂及配制

3.1.3 AHAS活力抑制

3.2结果与分析

3.3小结

第4章丙酯草醚对小麦根生长的抑制作用

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2试剂与丙酯草醚溶液配制

4.1.3丙酯草醚对植物生长的抑制作用——根长法

4.1.4丙酯草醚对不同敏感性小麦品种根生长抑制的剂量效应

4.2结果与分析

4.3小结

第5章小麦微粒体对丙酯草醚的代谢作用初探

5.1材料与方法

5.1.1植物材料及其预处理

5.1.2试剂

5.1.3微粒体制备

5.1.4酶促反应

5.1.5反应产物的HPLC分析与放射性活度测量

5.1.6酶促反应产物的HPLC-MS分析

5.2结果与分析

5.2.1代谢产物分离与分析

5.2.2酶促反应产物的HPLC-MS分析结果与结构分析

5.3 讨论

5.3.1酶促反应产物的HPLC-MS分析

5.3.2小麦微粒体对丙酯草醚的代谢途径

参考文献