中华蜜蜂头部ESTs文库构建和主要触角特异蛋白基因克隆、定位及其表达鉴定

摘要

中华蜜蜂apes cerana cerana(简称中蜂)为原产我国的本土蜜蜂，具有较西方蜜蜂Apis mellifera L(简称西蜂)更敏锐的嗅觉，如具有善于利用零星蜜源的能力，通常气味结合蛋白OBPs直接参与了嗅觉感器识别感知外界气味分子的过程；另外中蜂有着敏锐准确的鉴别能力和强烈的排异性，及作为原始寄主对雅氏瓦螨Varroa jacobsoni的适应抗性，化学感受蛋白CSPs可能直接参与了中蜂的这种排异行为以及抗螨过程。 本论文通过构建cDNA文库并结合批量ESTs测序，对中蜂头部功能基因进行了分析。在此基础上，着重通过对中蜂主要的触角特异蛋白——Ac-ASP1，Ac-ASP2(气味结合蛋白OBPs)和Ac-ASP3(化学感受蛋白CSPs)进行基因克隆，并通过其在触角中的转录表达谱和在触角不同感器内的亚细胞定位，以期对上述分子进行鉴定，最终对揭示中蜂灵敏的嗅觉以及独特的排异和抗螨能力奠定重要的基础。具体的研究结果如下： 1．构建了包含十三个日龄的中蜂头部cDNA文库。通过LD-PCR技术有效地合成出全长ds-cDNA和组织中低丰度的mRNA，电泳结果显示，合成的ds-cDNA在0.6～1.0kb之间有数条可见的条带，显示为高丰度的基因。对未扩增文库和扩增文库分别采用PCR扩增和蓝白斑鉴定的方法证明构建文库的重组率较高(重组率分别达到90％和97.6％)，且库容高(未扩增文库的滴度达到1.25×10<'6>pfu/ml，扩增文库的滴度约为1.74×10<'9>pfu/ml)。 2．基于构建好的中蜂cDNA文库，利用批量化ESTs测序策略，成功得到了质量较好的有效ESTs序列862条，经拼接后分别得到“Contig”和“Singleton”序列68个和184个。将拼接后的序列进行注释，ESTs库中存在相当数量的高丰度基因，如王浆蛋白1(major royaljelly protein 1，MRJP1)，王浆蛋白2(major royalielly protein 2，MRJP2)，葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOX)和王浆多肽(Apisimin)等，以及与触角信息传递相关蛋白如气味结合蛋白OBPl5等多种功能基因，为以后的研究提供了基础。 3．根据西方蜜蜂的研究，我们从中蜂触角中首次克隆TAc-ASP1，Ac-ASP2与Ac-ASP3等三个主要的触角特异蛋白基因序列ORF全长，GenBank登录号分别为DQ449670、DQ449667与DQ449669。序列分析可知Ac-ASP1，Ac-ASP2均具有6个保守的半胱氨酸，而Ac-ASP3具有4个保守的半胱氨酸。通过多序列联配、系统发育树及序列相似性分析，Ac-ASP除与西方蜜蜂Am-ASP亲缘关系较近(相似性达到80％以上)外，与其它膜翅目以及鞘翅目的OBPs及CSPs也有一定的亲缘关系(相似性达到30～60％)，且Ac-ASP1和Ac-ASP2应为OBPs，Ac-ASP3则应为CSPs。 4．利用Real-time PCR技术，分析了Ac-ASP1，Ac-ASP2与Ac-ASP3基因的时空表达情况，结果表明该三个基因的表达模式为：Ac-ASP1高丰度地表达于工蜂触角，而在其它器官(如头、胸、腹、翅及足)中呈低丰度表达；Ac-ASP2特异地表达于工蜂触角，在其它器官中均不表达；Ac-ASP3除在触角中表达外在其它器官中也表达，但表达丰度不均一。在各发育历期中，Ac-ASP1在幼虫、蛹期到6日龄以及21日龄前后具有两个表达高峰，二者表达丰度相当；Ac-ASP2在幼虫及蛹中均不表达，在成虫中具有几个丰度较高的日龄，即1、9、15、27、30日龄，这两个高表达时期均要较其它时期高出近十倍以上：Ac-ASP3在从蛹期到6日龄以及18日龄前后具有两个表达高峰，其中前者的平均表达丰度约为后者的两倍。 5．对中蜂主要的触角特异蛋白基因序列中的普通气味结合蛋白Ac-ASP2和化学感受蛋白Ac-ASP3进行了原核表达，其中Ac-ASP2为包涵体表达，而Ac-ASP3为可溶性表达。二者分别通过梯度尿素洗涤和镍NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化，每升LB培养基分别可以得到50mg和15mg的抗原量。从纯化效果看，Ac-ASP3纯度要Ac-ASP2高，但是后者的得率要比前者高。二者均作为免疫抗原制备了多抗血清，经双向免疫扩散试验测定效价，Ac-ASP2和Ac-ASP3的抗血清效价分别达到1∶32和1∶64，特异性好且效价高，完全符合免疫探针制备要求。 6．制备了Ac-ASP2和Ac-ASP3相应的胶体金探针。利用免疫电镜对中蜂Ac-ASP2和Ac-ASP3在触角感器中进行亚细胞定位鉴定，其中Ac-ASP2表达于板形感器(sensilla placodea，sp)、毛形感器A(sensilla trichoidea A，stA)等嗅觉感器，表明Ac-ASP2参与中蜂触角嗅觉识别机制；Ac-ASP3则主要表达于锥形感器(sensilla basiconica，sb)和毛形感器B(sensilla trichoidea B，stB)等机械感器内，表明Ac-ASP3可能参与中蜂触角的机械运动。对于最终揭示两者在中蜂嗅觉系统及化学感受系统中的功能及作用机制提供了重要的参考。

目录

论文说明：符号说明

摘要

第一章文献综述

1引言

2昆虫OBPs与CSPs一般特性

2.1 OBPs一般特性

2.2 CSPs一般特性

3昆虫OBPs与CSPs的表达

3.1 OBPs的表达

3.2 CSPs的表达

4昆虫OBPs与CSPs的功能

4.1 OBPs的作用机制与生理功能

4.2 CSPs的作用机制与生理功能

5昆虫OBPs与CSPs的分子结构

6蜜蜂Apis mellifera的OBPs与CSPs研究进展

6.1 OBPs的研究进展

6.2 CSPs的研究进展

6.3触角特异蛋白ASP(antennal-specific protein)介绍

7选题依据与研究意义

8技术路线

第二章中华蜜蜂头部cDNA文库的构建

1引言

2材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.2中蜂头部总RNA的提取及电泳检测

2.3 mRNA的分离与纯化(亲和素磁珠法)

2.4 cDNA文库的构建

3结果与分析

3.1中蜂触角总RNA提取及RT-PCR

3.2双链cDNA片段的合成

3.3不同长度片段双链cDNA的分级分离

3.4未扩增文库滴度的测定及插入片段大小

3.5扩增文库滴度的测定

4讨论

第三章中华蜜蜂头部ESTs序列测定与分析

1引言

2材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.2 cDNA文库的ESTs测序

2.3 ESTs序列处理及注释分类

3结果与分析

3.1 ESTs序列的处理

3.2 ESTs序列的功能注释

3.3 ESTs序列的分类

4讨论

第四章中华蜜蜂主要ASP基因克隆与分析

1引言

2材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.2中蜂触角总RNA提取

2.3引物设计

2.4反转录合成cDNA第一链

2.5 PCR及其扩增产物的克隆

2.6中蜂主要ASP基因序列分析

3结果与分析

3.1中蜂主要ASP基因PCR扩增

3.2阳性克隆鉴定

3.3中蜂主要ASP基因序列分析

4讨论

第五章Real-time PCR鉴定中蜂ASP基因转录时空表达

1引言

2材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.2中蜂总RNA的提取及纯化

2.3引物设计

2.4反转录合成cDNA第一链

2.5质粒标准品制备

2.6 Real-time PCR反应体系建立

2.7数据分析

3结果与分析

3.1质粒标准品定量

3.2中蜂总RNA的提取及纯化

3.3 Ac-ASP1转录水平上的时空表达

3.4 Ac-ASP2转录水平上的时空表达

3.5 Ac-ASP3转录水平上的时空表达

4讨论

第六章中华蜜蜂主要ASP基因的原核表达及多抗制备

1引言

2材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.2 Ac-ASP原核表达载体的构建与鉴定

2.3Ac-ASP融合蛋白的诱导表达

2.4融合蛋白的SDS-PAGE与Western blot鉴定

2.5融合蛋白诱导表达的形式分析

2.6基于不同表达形式的融合蛋白分离纯化

2.7融合蛋白的多克隆抗体制备

3结果与分析

3.1 Ac-ASP原核表达载体的构建与鉴定

3.2 Ac-ASP融合蛋白的诱导表达及形式鉴定

3.3Ac-ASP融合蛋白的分离纯化与Western blot鉴定

3.4 Ac-ASP融合蛋白抗血清制备与效价测定

4讨论

第七章中华蜜蜂主要ASP蛋白在触角感器中的免疫定位

1引言

2材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.2样品固定与SEM观察

2.3低温包埋

2.4超薄切片

2.5胶体金间接标记与TEM观察

3结果与分析

4讨论

结论

参考文献

博士期间发表论文(含待发表)

致谢