朱鹮多态性微卫星位点的筛选及物种的遗传多样性研究

摘要

朱鹮(Nipponia nippon)是我国特有的濒危鸟类物种。目前野生种群和圈养种群共有朱鹃约800只,均为1981年在洋县重新发现的两对繁殖个体的后代。为了制定有效的保护策略,本研究同时采集了朱鹮野生种群和圈养种群的样品(包括陕西洋县救护饲养中心和楼观台野生动物抢救饲养中心),筛选朱鹮本物种的多态性微卫星位点,同时利用这些位点深入地分析了朱鹮的种群遗传多样性和种群结构。本研究得到的主要研究结果为： 1.本研究采用磁珠富集法,筛了2000个克隆,得到120个阳性克隆。随机抽取其中60个克隆,经测序得到35个含微卫星重复的序列,其中30个序列可供设计微卫星引物。21对引物能成功扩增出预期大小的产物。对这21对引物进行多态性检测后,最终获得11对多态性微卫星引物。 2.选用的13个微卫星位点,11个位点选自本研究的结果,另2个位点选自其它文献。其中文献中的一个位点对所有朱鹮样品扩增结果全为杂合子,本实验筛选的其中一个位点因鬼影带存在错判,且显著偏离哈温平衡。因此,在朱鹮遗传多样性分析中放弃了这两个位点。 3.11对多态性微卫星引物的多态信息含量(polymorphic information content,PIC)值,最低为0.196,平均为0.323。多态信息含量偏低与朱鹮经历过严重的瓶颈效应密切相关。11对多态性微卫星引物的累积个体识别率达99.98％。因此,这些微卫星标记可以被用于朱鹮圈养种群的遗传谱系构建和重引入奠基种群的个体筛选。 4.11个微卫星位点,在朱鹮野生种群中(n=9),共检测到27个等位基因,4个私有基因全部存在于野生种群中,平均每个位点等位基因数为2.45个,平均期望杂合度为0.499。在洋县种群和楼观台种群中(n=48),都检测到23个等位基因,平均每个位点等位基因数为2.091个,平均期望杂合度分别为0.383和0.378。t检验表明,野生种群的平均期望杂合度显著高于洋县种群(P=0.005)和楼观台种群(P=0.007)。因此,三个朱鹮种群的遗传多样性水平排序为：野生种群>洋县种群>楼观台种群。 5.BAPS(Bayesian Analysis of Population Structure)软件在未知种群信息的前提下对107个朱鹮个体进行类群分析,发现这些朱鹮个体被分为7个类群(LGT1,LGT2,YX1,YX2,YX-Wild1,YX-Wild2和Wild)。用POPULATION软件构建无根邻接树,结果显示不论在个体水平还是在类群水平上,都支持分为两个独立的类群,即“楼观台类群”和“洋县-野生类群”,而不是预期中的没有产生分化的一个种群或分为了野生种群与洋县-楼观台种群。种群分配测试结果显示,错误分配只出现在“楼观台类群”或“洋县-野生类群”内,而将个体分配到“楼观台类群”或“洋县-野生类群”的正确率达到了100％。 6.遗传混合分析显示,洋县种群和楼观台种群已产生了种群内分化(YX1,YX2：LGT1,LGT2),且楼观台种群内的分化程度高于洋县种群。 7.分子变异分析(AMOVA)的结果显示：“楼观台类群”和“洋县-野生类群”已发生了显著的分化(P<0.001)。以上结果说明,朱鹮的野生种群、洋县种群和楼观台种群在遗传上已经分化为两个不同的类群：(1)：楼观台类群；(2)：洋县-野生类群。 8.楼观台种群建于2002年,是在洋县圈养种群分出的30对朱鹮的基础上建立起来的,只经过了短短的5年时间,它们之间就在遗传上产生了分化,且这两个种群都产生了种群内分化。基于以上研究结果,我们提出如下保护建议： 1)在建立一个新的人工圈养种群时,管理者首先必须调查建群者的遗传背景,选择遗传多样性丰富,遗传结构合理的个体作为建群者,弥补在种群发展过程中遗传多样性的丢失,以保证种群更好的发展。 2)用科学的管理方法管理人工圈养种群。管理者应该利用SPARKS软件做好谱系记录工作,并结合MateRx软件和PM2000软件分别给出的配对适合指数和亲缘关系值制定合理的繁殖计划。运用好这些软件,管理者才能选择亲缘关系较远的,遗传结构合理的个体进行繁殖配对,从而避免在饲养过程中产生种群内的分化,减小遗传漂变的影响,最大程度保持建群者的遗传多样性一代一代传递下去。 3)在选择野生外放归的个体时,由于洋县种群个体比楼观台种群的个体有更好的进化潜力和遗传适应性,应优先考虑洋县种群的个体,而楼观台种群的个体不适宜实施野外放归。

目录

声明

摘要

第一章朱鹮鸟的生物学研究概述

1 形态特征

2栖息地及种群分布

3种群现状

4食性及采食行为

5生长发育及繁殖

6寄生虫感染和疾病感染概况

7饲养繁殖

8朱鹮研究概况

第二章微卫星标记及其在保护遗传学中的应用

1微卫星的结构

2微卫星的发现与命名

3微卫星形成的原因

4微卫星DNA的类型

5微卫星的特点

6微卫星位点的分离

7微卫星在保护遗传学中的应用及其优劣之处

第三章本研究的目的和意义

第四章材料与方法

第一节材料

1 样品

2 试剂

3主要仪器设备

第二节方法

1 DNA提取

2含微卫星重复的DNA片段筛选

3引物设计与检测

4数据分析

第五章研究结果

第一节微卫星位点筛选

1 DNA提取的电泳检测结果

2基因组DNA酶切的电泳检测结果

3接头连接成功后的PCR检测结果

4磁珠富集后PCR检测结果

5单克隆的PCR检测结果

6测序结果

7引物设计

8引物的PCR检测

9微卫星位点的多态性检测

第二节朱鹮遗传多样性分析

1哈温平衡与连锁不平衡检测

2微卫星位点多态信息含量及个体识别率

3微卫星遗传多样性

4种群结构和遗传分化

第六章讨论

第一节微卫星位点筛选

1筛选方法的选择

2磁珠富集法中应注意的几个关键问题

第二节朱鹮的遗传多样性及种群结构

1遗传多样性

2遗传多样性和繁殖适合度的下降

3朱鹮种群的遗传分化

第七章保护、管理建议与研究展望

1野生种群的保护

2圈养种群的管理

3放归建议

4研究展望

参考文献

本研究的主要成果及创新点

附录

致谢