东北虎多态性微卫星位点的筛选及其研究

摘要

东北虎(Panthera tigris altaica),又称阿穆尔虎或乌苏里虎,是世界上现存最大的猫科动物,野生种群现主要分布俄罗斯远东、中国东北和朝鲜北部。19世纪东北虎的分布仍很广泛,20世纪初受到人类的直接猎杀和生存环境的恶化,伴随着野生种群数量的锐减,分布区逐渐缩小。现已成为世界上最为濒危的大型猫科动物之一,我国列入了国家Ⅰ级重点保护动物,同时IUCN将其确定为极危种(CR),CITES也把东北虎列入了附录I。 为了研究该物种的遗传信息进而采取合理的保护策略,本文以采自桂林“雄森熊虎山庄”的一个圈养东北虎个体的血样为基础,利用磁珠富集法原理,筛选东北虎物种特异的多态微卫星位点,并利用60个圈养个体对这些多态位点进行了进一步分析,针对数据结果提出了相应的保护和研究建议。主要的研究结果如下： 1.本研究中,由一个东北虎基因组DNA出发,利用磁珠富集法筛选获得了20个3核苷酸和4核苷酸重复的多态性微卫星位点； 2.所筛选获得的总20个微卫星位点的累积个体识别率(CDP)达到1.000。各位点等位基因数据经Cervus处理,上述位点的累积排除率,当双亲遗传信息未知时为0.9934,当双亲之一的遗传信息已知时为0.9999; 3. 20个多态位点在60个圈养个体中共检测到89个等位基因,各位点等位基因数最低为2个,最高为9个,平均为4.50个,平均多态信息含量(PIC)为0.545。所有检测个体中,20个微卫星位点的平均期望杂合度(HE)为0.609,平均观测杂合度(HO)为0.617; 4. 20个多态位点的哈温平衡检测,结果显示位点421H111、431B12、442A7、442D9、443F2、89B10、726H6显著偏离哈温平衡(P<0.05),而且以下位点如421B121、431B12,441C6、442A7、89B10的观测杂合度(HO)小于其期望杂合度(HE),则推测该圈养种群内存在近亲繁殖现象； 5.本文提出,导致近亲繁殖产生的原因为圈养个体的谱系不清,血缘关系混乱,从而导致繁殖管理不合理.基于目前东北虎圈养情况及近期的研究成果,本研究认为,今后的东北虎保护工作,应对全国范围的东北虎圈养种群进行全面的调查分析,整理出明确的谱系结构,在此基础上结合各种先进的繁殖管理办法,有针对性地加强圈养种群间的基因交流,更好地保护东北虎的遗传多样性；并尽快建立个体特异的基因身份证,为整个种群层面的管理和保护提供前提条件。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

第一部分前言

一、 东北虎研究综述

1东北虎的分布与生物学特征

2东北虎现状

3东北虎的相关研究

二、 微卫星概述

1微卫星的发现

2微卫星的特点

3多态性微卫星位点的获得

4微卫星在保护生物学中的应用

三、 本研究的目的意义

第二部分材料和方法

一、 材料

1样品

2主要试剂

3所用接头与引物序列

4主要仪器设备

二、 方法

1基因组DNA的提取

2含微卫星DNA片断的获得

3微卫星引物的设计与检测

4微卫星数据的采集、整理和校正

5微卫星数据的处理和分析

第三部分结果与讨论

一、 微卫星位点的筛选

1东北虎基因组DNA的提取

2 DNA的酶切

3 DNA片断与接头的连接

4磁珠富集

5阳性克隆的筛选

6阳性克隆的测序

7引物设计

8引物效率的检测

9微卫星位点的多态性检测

二、东北虎遗传多样性分析

1哈温平衡与连锁不平衡检测

2微卫星位点多态信息含量及个体识别率

3圈养东北虎遗传多样性

三、讨论

1微卫星扩增中的链滑动错配

2微卫星位点的筛选

3东北虎圈养种群的遗传多样性

4东北虎的保护对策和研究建议

本研究的主要成果及创新点

参考文献

附录东北虎微卫星扩增数据

作者简历