里氏木霉Trichoderma reesei自噬相关基因TrATG5的克隆与功能分析

摘要

里氏木霉Trichoderma reesei属于半知菌亚门Deuteromycotina、丝孢目Hyphomycetales，有性态为红褐肉座菌Hypocrea jecorina。目前研究主要在酶基因克隆、重组蛋白过量表达机制、菌株遗传改造等方面.但是，关于其细胞自噬基因的研究目前还未见报道。 细胞自噬是真核生物在进化上和功能上广泛存在的保守过程，是细胞内长寿命蛋白或细胞器降解与再利用的过程。本文主要目的是通过基因敲除的方法来研究和阐明自噬基因在里氏木霉中的主要功能。获得的主要研究结果如下： 1.比对稻瘟菌Magnaporthe oryzae MgATG5氨基酸序列，在里氏木霉基因组文库中检索得到同源基因(相似度为59％)，定名为TrATG5.然后，利用分子生物学手段，构建了TrATG5基因置换载体。 2.本研究成功探索了利用根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)手段在木霉菌里进行基因敲除的方法。置换载体经ATMT转化后，利用同源双交换的方法将TrATG5基因靶定敲除，确认得到了TrATG5缺失突变体△TrATG5. 3.△TrATG5突变体在PDA培养基上的菌落形态发生变化，菌落颜色黄色，菌丝光秃稀疏，产孢量显著下降；在SNA培养基上生长速率有所下降。 4.将△TrATG5突变体和立枯丝核菌Rhizoctonia solani对峙培养，显微镜下观察后，发现重寄生依然发生；里氏木霉野生型菌株QM9414基本上不能利用蔗糖，而△TrATG5可以利用蔗糖正常生长。还原糖测定结果显示，△TrATG5具备了蔗糖利用能力。

目录

文摘

英文文摘

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致谢

第一章 引言

1 细胞自噬

1.1细胞自噬的形态特点及功能

1.2细胞自噬的分子机制

1.3自噬体的检测方法

1.4自噬与凋亡的关系

2 根癌农杆菌介导的遗传转化技术（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）

2.1根癌农杆菌介导的木霉遗传转化的原理及特点

2.2 ATMT在木霉转化中的应用实例

2.3 ATMT应用前景

3 木霉生防机制

3.1产生抗菌类物质

3.2重寄生作用

3.3溶菌作用

3.4竞争作用

3.5诱导寄主产生抗性(induced resistance)

3.6协同拮抗作用

4 本研究的意义

第二章 材料与方法

1 试验菌株

2 培养基

3 实验常用试剂与仪器

4 木霉菌种的保存与培养

5 常规分子生物学实验技术

5.1常规PCR、长片段PCR

5.2 DNA酶切

5.3酶切片段的去磷酸化(CIP)

5.4 DNA的琼脂糖电泳

5.5 DNA片段的凝胶回收

5.6连接反应

5.7 E Coli DH5A感受态细胞的制备

5.8大肠杆菌转化

5.9 CTAB法提取质粒

5.10序列测定

6载体构建过程见结果部分

7农杆菌的冻融法转化

8木霉菌的T-DNA转化

9转化子DNA提取与分析

9.1基因组DNA提取

9.2 PCR验证

9.3 Southern杂交

10还原糖测定

第三章 结果与分析

1里氏木霉Trichoderma reesei TrATG5基因序列分析

2 TrATG5基因置换载体的构建

2.1构建策略

2.2基因上游片段TrATG5-up和下游片段TrATG5-low的克隆

2.3基因上下游片断与PCAMBIA1300载体的连接和酶切验证

3 ΔTrATG5突变子的获得

4互补载体HBTrATG5-SUR的构建

5表型分析

5.1菌落形态

5.2生长速率

5.4分生孢子梗和分生孢子

5.5对峙培养

6还原糖的测定

第四章 讨论与今后的工作

1.全文讨论

1.1细胞自噬过程是真菌发育所必须的过程

1.2细胞自噬是有机物周转所必须的过程

2本研究的创新点

3今后的研究工作

参考文献

作者简历