口腔鳞状上皮细胞癌组织和患者血清、唾液蛋白质组学诊断模型的建立

摘要

目前口腔鳞癌发生、发展、转移和复发的系统性研究中的关键问题是缺乏明确的肿瘤早期诊断性标记物，因而寻找灵敏度高、特异性强、检测方便的标记物用于肿瘤早期发现和早期诊断成为学者的研究热点，如何提高分析和联合运用这些标记物的问题成为肿瘤研究的新亮点。无论是基础研究还是临床研究，多个分子水平的比较研究尚无报道，在肿瘤蛋白标记的整合应用方面还是空白。联合运用肿瘤标记物及交叉验证其灵敏度和特异性的研究正在探索中。 肿瘤蛋白质组学的主要研究内容一方面是建立肿瘤的全蛋白表达谱，精确肿瘤的分类鉴定；另一方面是研究肿瘤细胞与正常细胞的蛋白表达差异，筛选出特异蛋白，构建肿瘤发生、发展的蛋白质组谱，发现与评估组织、体液中的特异蛋白作为生物标记，运用于临床进行肿瘤早期诊断和个体化治疗，提高患者生存率和生活质量，以及判断疗效和预后，寻找新的治疗靶标。 蛋白标记物的研究对象主要包括体液和组织。在血清之外，唾液作为与口腔肿瘤密切相关的特征性体液，具有采集方便、无创伤等优势。对口腔肿瘤的研究兴趣包括其在体液和组织中的蛋白表达差异。借助于目前国际公认最有希望的肿瘤早期检测技术SELDI-TOF-MS和激光捕获显微切割LCM技术以及整合性生物信息学手段，本课题期望通过对血清、唾液、组织的研究构建一个口腔肿瘤标记物研究的功能蛋白质组学立体架构：血清、唾液、组织三种生物成份构成水平型的高通量蛋白分析；正常组织、癌前病变、癌变、转移灶、复发肿瘤的蛋白分析构建垂直型的序列分析。从而对口腔粘膜上皮的癌前病变、癌变、复发和转移的早期诊断模型的建立进行初步研究。 第一部分口腔鳞状细胞癌患者的血清蛋白质图谱分析　　应用SELDI-TOF-MS技术，采用CM10蛋白质芯片，检测28例原发性OSCC患者、8例区域性转移OSCC患者、6例白斑患者和32例健康志愿者血清蛋白质质谱数据，Biomarker Wizard 3.1秩和检验，比较筛选组间差异性蛋白质峰，再利用浙江大学肿瘤研究所ZUCI-PDAS数据处理软件、Matlab 6.5 SVM以及判别分析软件，得出两组间差异最显著的10个蛋白质峰数据进行分析，进一步筛选出Yoden指数最高的秩和比峰组合，建立诊断模型。 结果得出 血清诊断模型Ⅰ，为原发性OSCC患者与正常人的诊断模型：是质荷比分别为4181，3164，4652，．5952，3979，5985和4289的7个蛋白质峰。其中三个蛋白质峰(质荷比分别为3979，5952和5985)在OSCC患者血清中高表达，在正常人血清中低表达；而其余四个蛋白质峰(质荷比分别为4181，3.164，4652，4289)则在OSCC患者血清中低表达，在正常人血清中高表达。敏感性为93.75％(30／32)，特异性为92.86％(26／28)，总准确率为93.33％(56／60)。 血清诊断模型Ⅱ，为原发性OSCC患者和白斑患者的诊断模型：是质荷比分别为4162和6886的2个蛋白质峰。二者均在原发性OSCC患者血清中高表达，在白斑患者血清中低表达。敏感性为66.67％(4／6)，特异性为92.86％(26／28)，总准确率为87.82％(30／34)。 血清诊断模型Ⅲ，为正常口腔粘膜和白斑患者的诊断模型：是质荷比分别为4181和4651的2个蛋白质峰。二者均在正常口腔粘膜者血清中高表达，在白斑患者血清中低表达。敏感性为100.00％(32／32)，特异性为83.33％(5／6)，总准确率为97.37％(37／38). 血清诊断模型Ⅳ，对原发性OSCC患者与区域性转移OSCC患者的诊断模型：是质荷比分别为6195，5661，4289，4352和5072的5个蛋白质峰。其中三个蛋白质峰(质荷比分别为5661，4289和5072)在原发性OSCC患者血清中高表达，在区域性转移OSCC患者血清中低表达；而6195和4352在原发性OSCC患者血清中低表达，在区域性转移OSCC患者血清中高表达。敏感性为87.5％(7／8)，特异性为100％(28／28)，总准确率为97.22％(35／36)。 第二部分　口腔鳞状细胞癌患者的唾液蛋白质图谱分析　　按标准提取唾液标本，对17例口腔鳞癌患者、7例区域性转移患者、8例白斑患者和15例健康志愿者唾液蛋白质指纹图谱比较，用前述生物信息学方法建立诊断模型。 唾液诊断模型Ⅰ，为原发性OSCC患者与正常人的诊断模型：是质荷比分别为5797，2902，3883和4951的4个蛋白质峰。其中5797，．2902和3883在原发性OSCC患者唾液中低表达，在正常人唾液中高表达。4951在原发性OSCC患者唾液中高表达，在正常人唾液中低表达。敏感性为93.33％(14／15)，特异性为88.24％(15／17)，总准确率为90.63％(29／32)。 唾液诊断模型Ⅱ，为OSCC区域性转移患者与正常人的诊断模型：是质荷比分别为5446，4934，4968，3296，4800和2901的6个蛋白质峰。其中5446，4934，和3296在OSCC区域性转移患者唾液中高表达，在正常人唾液中低表达。4968，4800和2901在OSCC区域性转移患者唾液中低表达，在正常人唾液中高表达。敏感性为100.00％(15／15)，特异性为85.71％(6／7)，总准确率为95.45％(21／22)。 唾液诊断模型Ⅲ，为白斑患者与正常人的诊断模型：是质荷比分别为9515，2230，2238，5694和2646的5个蛋白质峰。其中9515和5694在白斑患者唾液中高表达，在正常人唾液中低表达。2230， 2238和2646在白斑患者唾液中低表达，在正常人唾液中高表达。敏感性为93.33％(14／15)，特异性为85.71％(6／8)，总准确率为86.96％(20／23)。 第三部分　口腔鳞状细胞癌患者的组织细胞学蛋白质图谱分析　　采用激光捕获显微切割技术，通过对21例口腔鳞癌OSCC组织和7例0LK患者各与其自身对照正常邻近粘膜上皮组织蛋白质质谱数据的比较，用前述生物信息学方法建立诊断模型。 组织学诊断模型Ⅰ，为原发性OSCC患者与正常人的诊断模型：是质荷比分别为3714，3515和4944的3个蛋白质峰。此3个蛋白质峰均在原发性OSCC细胞中高表达，在正常粘膜上皮细胞中低表达。敏感性为90.48％(19／21)，特异性为90.48％(19／21)，总准确率为90.48％(38／42)。 组织学诊断模型Ⅱ，为白斑患者与正常人的诊断模型：是质荷比分别为15122和7569的2个蛋白质峰。此2个蛋白质峰均在白斑上皮细胞中低表达，在正常粘膜上皮细胞中高表达。敏感性为85.71％(6／7)，特异性为100.00％(7／7)，总准确率为92.86％(13／14)。 组织学诊断模型Ⅲ，为原发性OSCC患者与白斑患者的诊断模型：是质荷比分别为3738和11366的2个蛋白质峰。3738在原发性OSCC组织中高表达，在白斑上皮细胞中低表达。11366在原发性OSCC组织中低表达，在白斑上皮细胞中高表达。敏感性为85.71％(6／7)，特异性为100.00％(20／20)，总准确率为96.29％(26／27)。 小结： 三种标本来源的正常组与原发性OSCC组诊断模型实验结果的准确率、特异性、敏感性均在88.24％以上。应用SEIDI-TOF-MS技术、CM10蛋白质芯片和生物信息学技术对口腔鳞癌患者血清、唾液和组织细胞中的蛋白标记物的研究和检测，在疾病的分期、复发、转移的预测和疗效分析以及早期发现、早期治疗中有潜在的可靠临床价值。唾液在肿瘤检测技术中的应用，以及激光捕获显微切割LCM技术等后续研究将对这些蛋白标记物进行蛋白鉴定。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

创新点

前言

材料与方法总论

第一部分口腔鳞状上皮细胞癌患者血清蛋白质图谱分析

1.材料与方法

2.结果

2.1模型一，原发性OSCC患者与正常人的血清鉴别

2.2模型二，原发性OSCC患者和白斑患者的血清鉴别

2.3模型三，正常口腔粘膜和白斑患者的血清鉴别

2.4模型四，原发性OSCC患者与区域性转移OSCC患者的血清鉴别

3.讨论

第二部分口腔鳞状上皮细胞癌患者唾液蛋白质图谱分析

1.材料与方法

2结果

2.1模型一，原发性OSCC患者与正常人的唾液鉴别

2.2模型二，OSCC区域性转移患者与正常人的唾液鉴别

2.3模型三，白斑患者与正常人的唾液鉴别

3讨论

第三部分口腔鳞状上皮细胞癌患者组织细胞学蛋白质图谱分析

综述1:口腔粘膜癌前病变的诊断治疗新策略

综述2:口腔颌面部肿瘤类疾病9056例回顾性分析

在读期间成果

何虹简介

致谢