内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与冠心病的相关性分析

摘要

背景： 冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是当今威胁人类健康的主要疾病之一，冠心病是多种遗传因素和环境因素相互作用所致的多基因疾病，年龄、高血压、吸烟、肥胖等传统危险因素已广为人知。近年来，冠心病相关基因的定位和识别成为研究的热点，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因已被列入冠心病研究的备选基因。 一氧化氮(NO)是细胞的一种重要生物活性介质，几乎参与各种疾病的病理生理过程，也是冠心病的发生的病理生理基础。一氧化氮合酶是体内NO水平及其生成的唯一限速酶，其活性与遗传有关。生理状态下主要由内皮型(eNOS)调节NO的持续生成。 NO水平与内皮型一氧化氮合酶基因的多态性密切相关。人eNOS基因编码1203个氨基酸，定位于染色体7q35-q36，全长21～22kb，包括25个内含子和26个外显子。eNOS基因存在多种多态性，其中G894T多态性与冠心病关系密切，G894T多态性可导致所编码的氨基酸Glu298Asp多态性。结构决定功能，Glu298Asp多态性可能就意味着eNOS功能多态性，导致eNOS活性降低，NO水平下降，促进动脉粥样硬化。本研究旨在探讨内皮型一氧化氮合酶基因(eNOS)G8941、多态性与冠心病的关系，并初步了解传统的危险因素、遗传因素在冠心病发生、发展中的作用。 研究对象： 冠心病组：196例冠心病患者选自浙江大学医学院附属第二医院心内科，符合世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，所有患者经冠状动脉造影证实。 对照组：189例非冠心病组人群选自浙江大学医学院附属第二医院心内科冠状动脉造影阴性或未达到冠心病诊断标准的患者。 本研究人群个体之间无血缘关系，均为汉族人。 研究方法： 冠状动脉病变的评价冠状动脉造影证实时，以左前降支、左回旋支、右冠状动脉及主要分支中任何一支血管狭窄程度≥50％为阳性。并根据累及支数定义为单支、双支和三支病变，累及左主干者记作双支病变，统计病变血管支数。 基因组DNA抽提和eNOS G894T基因多态性检测 1.白细胞基因组DNA抽提：酚／氯仿法提取外周血白细胞DNA。 2.eNOS G894T基因多态性检测：采用PCR-RFLP技术。上游引物：5’-CATGAGGCTCAGCCCCAGAA C-3’下游引物：5’-AGTCAATCCCTTTGGTGC TCAC-3。PCR反应体系共25μl，PCR反应体系共25ul：10×PCR缓冲液2.5ul，样本DNA 2.5ul，Taq DNA聚合酶0.25ul(1u)，dNTP 0.5ul，MgCl21.5ul，引物终浓度均为0.5umol／L。扩增条件：在PCR仪上扩增，95℃预变性5分钟，95°C变性45秒，60°C退火45秒，72°C延伸1分钟，共30个循环后72°C终末延伸5分。PCR产物以2％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5ug／ml)电泳，以85V电泳30分钟，UA凝胶成像仪上观察是否有PCR产物并摄影保存。酶切反应：取PCR产物10ul，Mob I内切酶10U，10×酶切缓冲液2ul，反应总体积25ul。在37°C水浴16小时，一旦第894位点出现G→T，206bp的PCR产物就会被切割为119bp和87 bp的片断。酶切产物以2％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5ug／ml)电泳，以85V电泳30分钟，UA凝胶成像仪上观察并摄影保存。 统计分析以直接计数法计算冠心病组患者和对照组的基因型和等位基因频率，组间比较采用x2检验。资料分析应用SPSS 10.0软件包作统计学处理。遗传平衡吻合度x2检验群体基因型分布是否符合Hardy-weinberg平衡定律。计量资料均采用均数±标准差(X±S)表示，组间均数间统计学差异用t检验，各组基因型和等位基因频率之间的比较用x2检验，相对危险度以比值比(OR)的95％的可信区间(95％CI)来表示，pO．05)。 2.冠心病组基因型分布及基因突变频数明显高于对照组，冠心病组吸烟者与对照组对比差异更明显，x2检验结果分别为：x2=7.97，p<0.01和x2=10.58，p<0.01。 3.吸烟者与非吸烟者基因型分布及等位基因频率比较x2分别为5.82、5.77，p值均小于0.05。 4.GT+TT基因型分布在冠心病单支病变组与双支+三支病变组无显著差异；在冠心病吸烟者中表现出显著差异，x2=6.48，p<0.05。 5.冠心病组吸烟合并高血压病者与吸烟的无高血压病者等位基因频率比较x2=4.36，p<0.05。 6.冠心病单支病变组GT+TT／GG为11／61与双支+三支病变组的33／91比较，x2=3.36，p>0.05；而冠心病吸烟者x2=6.48，p<0.05；冠心病吸烟组中伴高血压病组x2=4.354，p<0.05。基因频率分布对比结果一致。 结论： 1.浙江地区汉族人群中存在G894T基因多态性。 2.G894T基因突变可增加个体对冠心病的易感性，与冠状动脉病变严重程度无关。 3.吸烟可能诱发G894T基因突变，G894T基因突变使吸烟者冠心病发病率更高，病变范围更广。 4.随着危险因素的增多，吸烟者G894T基因突变可能增多，冠状动脉病变趋向严重。

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结果

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结束语

参考文献

内皮型一氧化氮合酶G894T基因多态性与冠心病的关系

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