一个来自于稻瘟病菌的免疫诱导蛋白的鉴定和功能分析

摘要

植物在一定的诱导因子(又称激发子)作用下，产生对随后病原菌侵染的抗性增强，这种现象称为诱导免疫(induced immunity)。激发子本身没有杀菌活性，但可以通过活化植物体内的免疫机制从而诱导植物产生抗性。近年来，一些微生物来源的蛋白类免疫诱导因子引起人们的广泛关注。这类激发子对植物无毒、作用剂量小、环境友好，因而在开发环境友好型作物病害免疫诱导剂中具有广阔前景。本项目从稻瘟病菌中分离鉴定了1个免疫诱导蛋白基因MgSM1，采用农杆菌介导的瞬间表达技术以及转基因技术研究了MgSM1蛋白的免疫诱导活性及其可能的机理。 根据其他微生物中SM1基因的序列信息，采用生物信息学方法克隆了稻瘟病菌的SM1基因cDNA，命名为MgSM1。MgSM1包含一个414bp的ORF，编码一个138个氨基酸的蛋白，含有一个高度保守的Cerato-platanin(CP)的4个半胱氨酸二硫键。RT-PCR分析表明，MgSM1在稻瘟病菌侵染水稻过程中有明显的表达；另外MgSM1基因在稻瘟菌的整个生活史中都有表达。 为了研究MgSM1蛋白的免疫诱导活性，将MgSM1的ORF序列克隆到pFLAG-CTS1质粒上，形成C-末端与FLAG序列融合的重组蛋白，并将整个MgSM1-FLAG构建克隆进由DEX诱导表达型启动子驱动目的基因表达的pINDEX3双元质粒中。采用农杆菌介导瞬间表达方法，分析了MgSM1在普通烟、本氏烟、番茄、拟南芥和水稻等不同植物上的免疫诱导活性。结果表明，在农杆菌注射并经DEX诱导处理后，供试植物在短时间内(处理后6小时)注射叶片组织发生过敏性反应(hypersensitivity response，HR)，导致细胞死亡，组织崩溃。在普通烟、本氏烟、番茄、拟南芥和水稻等植物叶片上，MgSM1的瞬间表达可引起注射叶片中活性氧的产生，注射叶片的电导率升高，HR指示基因表达增强。这些结果说明，MgSM1可以在多种植物上引起HR反应。 为了明确MgSM1处理后，不同植物植株是否激活体内防卫反应并提高抗病性，分析了MgSM1处理植株体内防卫基因的表达并测定了上部叶片的抗病性。RT-PCR结果表明，注射MgSM1并经DEX诱导后，烟草、番茄、拟南芥和水稻植株的注射叶片PR基因表达上调，而且在注射叶片上部非注射叶片中PR基因也出现上调表达。这些结果说明，MgSM1作用后不仅激活了注射叶片局部组织的防卫反应，而且也活化了未处理叶片组织中的防卫反应。抗病性测定结果显示，在注射MgSM1并经DEX诱导处理的番茄中，上部未处理叶片上接种灰霉菌(Botrytis cinerea)后，病害程度明显低于对照；同样，在注射MgSM1并经DEX诱导处理的拟南芥植株中，上部叶片上接种B.cinerea和Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)DC3000后，灰霉病病害症状和B.cinerea的生长量菌明显低于对照，PstDC3000引起的病害症状和细菌菌量也明显低于对照。这些结果说明，MgSM1作用后，通过激活植株体内的防卫基因表达，提高了植株对多种病害的抗病性。 为了进一步研究MgSM1在调控抗病反应中的功能，本研究将MgSM1基因导入拟南芥，经抗性分离筛选和分子鉴定获得3个单拷贝插入的过量表达MgSM1转基因纯合株系(＃2、＃7和＃11)。在未经DEX处理时，MgSM1转基因植株与野生型植株无明显形态和发育上的差异。在DEX处理后，能检测到MgSM1的表达，而且高浓度DEX处理时植株生长受到抑制，甚至死亡。抗病性试验表明，MgSM1转基因拟南芥植株增强了对PstDC3000、B.cinerea和Alternariabrassicicola的抗性。接种PstDC3000后，MgSM1转基因植株叶片中病害症状减轻，叶片中细菌数量比对照下降2个数量级；喷雾接种B.cinerea后，MgSM1转基因植株病害明显低于对照，B.cinerea生长量也明显低于对照；离体叶片接种A.brassicicola后，MgSM1转基因植株叶片上病斑显著减小。RT-PCR分析表明，MgSM1转基因植株经DEX处理后，防卫基因如PR-1、PDF1-2和PR-5等的表达明显上调，对照植株中防卫基因表达没有变化。染色检测表明，DEX处理后MgSM1转基因植株叶片内有显著的过氧化氢和超氧阴离子等活性氧的产生与积累，而对照植株中则未检测到活性氧的积累。这些结果证明，MgSM1作用后，能激活植株体内防卫基因表达，并提高植株对多种病害的抗病性。 为了探索MgSM1在诱导抗病反应中可能涉及的信号途径，比较了MgSM1在不同抗病信号突变体上诱导抗病反应的变化。MgSM1在npr1、fls2-100、NahG、ein2和jar1-1等突变体植株叶片上引起的坏死反应明显强于其在野生型植株叶片上引起的坏死反应。MgSM1在NahG、npr1、ein2和jar1-1突变体上诱导防卫基因表达和抗病反应能力下降，表明MgSM1的作用需要SA和JA/ET途径的参与。但是，在fls2-100突变体中，MgSM1诱导防卫基因表达和抗病反应能力与在野生型中相似，说明MgSM1的作用不需要FLS2的参与。 为了明确MgSM1蛋白中的活性部位，构建了4个C-末端缺失的截断片断分子MgSM1-D1(缺失C端18个氨基酸)、MgSM1-D2(缺失C端38个氨基酸)、MgSM1-D3(缺失C端66个氨基酸)和MgSM1-D4(缺失C端84个氨基酸)，并用农杆菌介导的瞬间表达方法分析了截断分子的免疫诱导活性。结果表明：在拟南芥上，MgSM1-D1和MgSM1-D2具有与MgSM1全长片段相似的免疫诱导活性，并可诱导野生型拟南芥上的局部和系统性的PR基因表达，而MgSM1-D3和MgSM1-D4则丧失了免疫诱导活性。这些结果表明，MgSM1蛋白的免疫诱导活性部位可能存在于其C-端，位于MgSM1蛋白的第71至第99个氨基酸之间。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

致谢

第一章文献综述和研究背景

1.1植物非诱导抗性反应(组成型抗性)

1.2诱导抗性反应

1.2.1激发子

1.2.2病原菌产生的肽和蛋白激发子

1.3分泌蛋白(secreted protein)

1.3.1细菌分泌的激发子蛋白

1.3.2卵菌分泌的激发子蛋白

1.3.3卵菌及其他真菌分泌的无毒蛋白激发子

1.3.4卵菌及其他真菌分泌的NLPs蛋白

1.3.5木霉菌分泌的激发子小蛋白

1.3.6真菌中的Cerato-platanin蛋白类群

1.4本课题的主要研究内容

第二章材料与方法

1供试稻瘟菌菌株与培养

2MgSM1基因的克隆

3 DNA的序列测定和分析

4MgSM1基因在稻瘟菌中的表达

4.1MgSM1基因在稻瘟菌纯培养条件下的表达

4.2MgSM1基因在稻瘟菌侵染水稻过程中的表达

5MgSM1基因植物转化双元表达载体的构建

6MgSM1在不同植物上瞬间表达后引起的过敏性坏死反应

6.1供试植物的准备

6.2MgSM1在不同植物上的瞬间表达

6.3MgSM1在不同植物上的瞬间表达动态分析

6.4MgSM1瞬间表达引发的植物叶片电导率变化

6.5MgSM1瞬间表达引发的植物叶片活性氧产生

6.6MgSM1瞬间表达引发的HR指示基因的表达变化

7MgSM1瞬间表达后植物防卫基因的表达动态

7.1局部性防卫基因的表达动态

7.2MgSM1瞬间表达后系统性防卫基因的表达动态

8 MgSM1诱导抗性

8.1 MgSM1在番茄上的诱导抗病性

8.2 MgSM1在拟南芥上的诱导抗病性

9 MgSM1活性区段的鉴定和分析

9.1 MgSM1截断分子的获得

9.2 MgSM1截断分子的活性分析

10 MgSM1介导的抗病反应信号途径

10.1 MgSM1处理后拟南芥突变体的防卫基因表达

10.2 MgSM1处理后拟南芥突变体的病害表型

11拟南芥转化以及转基因植株的筛选鉴定

11.1拟南芥转化

11.2转基因拟南芥植株的诱导表型分析

11.3转基因拟南芥植株的MgSM1基因诱导表达RT-PCR分析

12MgSM1转基因拟南芥抗病性测定

13 MgSM1融合蛋白的原核表达

13.1原核表达载体pET-32-a-MgSM1的构建和纯化

第三章结果与分析

1MgSM1基因的克隆及序列分析

2MgSM1基因在稻瘟菌中的表达

3MgSM1转化双元表达载体的构建与验证

4 MgSM1在不同植物上引起过敏性坏死反应

5MgSM1在不同植物上引起防卫反应

6 MgSM1诱导番茄和拟南芥的抗病性

7 MgSM1活性区段的鉴定

8 MgSM1作用的抗病信号途径

9过量表达MgSM1转基因拟南芥植株的获得

10转基因植株中MgSM1及PR1的诱导表达

11过量表达MgSM1的转基因植株提高抗病性

12MgSM1转基因植株中防卫反应的活化

13 MgSM1融合蛋白的获得

第四章讨论与小结

参考文献