蛋白酶体抑制剂PS-341调控泛素-蛋白酶体途径在重症急性胰腺炎中的治疗作用及机制研究

摘要

研究背景和目的：急性胰腺炎(AP)是一种严重威胁人类健康的常见疾病，临床病理变化复杂，对治疗的反应也各不相同，轻型水肿性胰腺炎是一种自限性疾病，对治疗反应好，多数可以治愈，而重症急性胰腺炎(SAP)起病急、进展快，早期即可发生全身炎症反应综合症(SIRS)、多器官功能不全(MODS)，虽然现在对SAP的治疗较以前有了长足的进展，但死亡率仍高达10％-30％。 重症急性胰腺炎的发病机制尚未完全明了，一直缺乏特异性的药物作用靶点，其临床治疗仍是一个国际性难题。现今观点认为重症急性胰腺炎的发病首先由胰蛋白酶在腺泡中异常活化引起胰腺腺泡细胞损伤，NF-kB活化、Ca2+浓度升高在这一过程中起重要作用；活化的NF-kB促使胰腺组织及炎性细胞释放大量的炎性介质如TNF-α，IL-6和ICAM-1等，炎性介质问相互作用导致炎症信号的进一步放大；上述促炎症介质和同时产生的抗炎症介质如IL-2、IL-10、IL-1Ra等构成一个复杂的网络系统，两者的平衡失调引最终导致胰腺损伤；同时，大量细胞因子释放入血、ROS、NO及COX-2的产生等将引起SIRS,过度SIRS造成远离组织器官的损伤，继发MODS、脓毒血症。据此，在疾病的早期应用加贝脂、抑肽酶等蛋白酶抑制剂或细胞因子拮抗剂如TNF-α单克隆抗体、PAF拮抗剂等来治疗重症急性胰腺炎，从理论上讲能够减轻胰腺损伤、抑制炎症反应，但随后大规模的临床RCT研究证实这些治疗方法均无效，其最主要的原因是细胞因子间都是相互作用、相互影响的，共同组成炎症信号反应网络系统，因此抑制单一炎症介质活性并不能阻断炎症信号反应系统介导的整个炎症反应的演进过程。 NF-KB是一种核转录因子，现被认为在重症急性胰腺炎的发病中起关键性调节作用。在正常细胞内，NF-kB和它的抑制性蛋白I-kB相结合，以非活性的形式存在于胞浆中。当细胞受到细菌、病毒、TNF-α、LPS等外源性刺激后，I-kB即发生磷酸化，进而泛素化，泛素化后的1-kB出即可被26S proteasome识别并降解；至此，活化的NF-kB便移位到细胞核中，结合到靶基因的转录起始区域，激活细胞因子、粘附分子和COX-2等的表达。26S proteasome是细胞内最主要的非溶酶体溶蛋白酶复合物，其通过细胞周期时限特异性的生物学机制精确的调控细胞内70-90％的蛋白降解，NF-kB的抑制因子I-kB及许多与细胞周期循环和凋亡相关的重要因子、转录因子等都经此泛素-proteasome途径降解。Bortezomib,又称PS-341，是一种强效、高度选择性的proteasome抑制剂，它通过和26S proteasome的20S亚基快速、可逆的结合抑制酶复合物的活性，进而抑制了I-kB的降解，使NF-kB活性受到抑制，降低了TNF-α、IL-1、IL-8、COX-2等的表达，并可通过抑制P21、P27、P53、Bax降解和激活JNK等途径诱导细胞的凋亡。2003年5月13日PS-341已被美国FDA批准进入临床用于多发行骨髓瘤的治疗，现临床Ⅲ期验证已经取得令人满意的效果，这是第一个也是目前唯一一个进入临床的proteasome抑制剂，其相关研究获得了2004年诺贝尔化学奖。鉴于调控着体内许多细胞因子的产生和活化、并在重症胰腺炎的发病中起着关键性作用NF-kB为Proteasome的重要作用靶点之一，而PS-341为目前公认的特异性最强的proteasome抑制剂，因此，本课题拟利用PS-341能够特异性抑制NF-kB活性、诱导细胞凋亡的作用机制来验证和阐释PS-341对SAP的治疗保护作用，并通过micro PET这一先进的影像学检查方法直接观察PS-341在小鼠体内对胰腺微循环和炎细胞活性的影响，以期PS-341能够成为一种新的治疗重症急性胰腺炎的有效手段，从而推动SAP治疗研究的进展。 本实验主要包括两部分研究内容：第一部分：PS-341对小鼠重症急性胰腺炎的治疗作用；第二部分：18F-FDG-PET在重症急性胰腺炎早期诊断和疗效评价中的应用价值。 第一部分 PS-341对小鼠重症急性胰腺炎的治疗作用 实验材料和方法：健康雌性ICR小鼠144只，体重20g±1g。随机分为PS-341治疗组，模型对照组和空白对照组，其中PS-341治疗组64只，模型对照组40只，空白对照组40只。重症急性胰腺炎模型的建立通过连续7次腹腔注射50ug／kg雨蛙素，每次间隔一小时，并在首次注射雨蛙素5小时后腹腔注射10mg／kg脂多糖。 为了确定PS-341的最佳有效浓度，不同剂量的PS．341(0.1，0.2，0.5，1.0mg／kg)在注射脂多糖半小时前腹腔内注入，模型对照组和空白对照组分别注射同等剂量的安慰剂，首次雨蛙素注射后8小时取血和胰腺组织，测血清淀粉酶、CRP和LDH。为了验证PS-341治疗的最佳有效作用时间，分别于用药后8小时、12小时和24小时将小鼠用50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取血、胰腺和肺组织，而后通过组织病理检测和western blot、ILISA、RT-PCR等经典的实验方法来验证PS-341对小鼠重症急性胰腺炎的治疗作用。 结果：本研究发现，PS-341的最佳有效浓度为0.5mg／kg，造模后8小时治疗效果最好。雨蛙素联合脂多糖小鼠腹腔内注射后，小鼠胰腺呈现典型的出血、坏死病理表现，血淀粉酶值明显升高，造模后小鼠肺脏病理结构改变表现为肺不张，肺泡渗出增多，炎性细胞浸润明显。生化及分子生物学检测示血清淀粉酶、C-反应蛋白、乳酸脱氢酶、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、胰腺组织中细胞黏附分子ICAM-1的表达都较空白对照组明显升高。PS-341治疗后，胰腺组织中I-kB降解减少， NF-kB活性显著下降，胰腺出血、坏死和炎细胞浸润明显减轻，肺泡渗出减少。血清淀粉酶、C-反应蛋白、乳酸脱氢酶、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、胰腺组织中细胞黏附分子ICAM-1的表达都较对照组显著下降，而组织中细胞凋亡数明显增多。 结论：雨蛙素联合脂多糖腹腔注射诱导小鼠重症急性胰腺炎模型是一种经典的实验方法。PS-341治疗后能够明显减轻重症急性胰腺炎的严重程度，血清淀粉酶、C-反应蛋白、乳酸脱氢酶、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、胰腺组织中细胞黏附分子ICAM-1的表达显著下降，组织病理损伤也明显减轻，因此，PS-341有可能成为新的治疗重症急性胰腺炎的有效药物，并在临床得到推广应用。 第二部分18F-FDG-PET在重症急性胰腺炎早期诊断和疗效评价中的应用价值 实验材料和方法：健康雌性ICR小鼠33只，体重20g±1g，随机分为PS-341治疗组，模型对照组和空白对照组，每组11只。重症急性胰腺炎模型的建立同上，空白对照组用等量的生理盐水代替雨蛙素和脂多糖腹腔注射。PS-341 (0.5mg/kg)在脂多糖注射前半小时腹腔内注入，模型对照组和空白对照组分别注射同等剂量的安慰剂。首次雨蛙素注射后8小时，将小鼠用50mg／kg的戊巴比妥钠腹腔麻醉，每组3只行PET胰腺扫描，另外8只取胰腺组织，匀浆后测MPO。 结果：正常对照组PET扫描时胰腺不显影，当诱导建立重症急性胰腺炎模型后，胰腺。18F-FDG的吸收率明显增高，PET图像上胰腺呈一鲜亮条带；PS-341治疗后胰腺18F-FDG的吸收率显著降低。MPO测定结果同PET一致，造模后MPO活性显著升高，PS-341治疗后MPO活性明显下降，进一步验证了18F-FDG-PET在重症急性胰腺炎诊断和疗效评价中的应用价值。 结论：18F-FDG-PET是一种直观、准确的分子影像学诊断方法，能够动态监测重症急性胰腺炎的发展和转归，评价干预治疗效果，为临床诊断和调整治疗方案提供依据。

目录

论文说明：英文缩略语表

前言

实验动物、设备、材料、药物与试剂

第一部分 蛋白酶体抑制剂PS-341对小鼠重症急性胰腺炎的治疗作用及机制研究

材料及方法

一、小鼠重症急性胰腺炎模型的建立

二、血清和组织标本采集:

三、标本处理

四、样本病理及生化、分子生物学检测

四、统计学方法

结果

一、PS-341最佳治疗剂量的选择

二、PS-341最佳治疗时间点的选择

三、PS-341-0.5mg/kg治疗，首次雨蛙素注射后8小时后各组胰腺病理改变

四、PS-341-0.5mg/kg治疗，首次雨蛙素注射后8小时后各组肺脏病理改变

五、PS-341治疗后胰腺组织中ICAM-1表达改变

六、PS-341治疗后血清中IL-1β和LI-6表达改变

七、PS-341治疗后胰腺组织中细胞凋亡的改变

八、PS-341治疗后胰腺组织细胞中IκBα的表达改变

九、胰腺组织中NF-κB活性测定

讨论

参考文献：

第二部分 18F-FDG-PET在重症急性胰腺炎早期诊断和疗效评价中的应用价值

材料及方法

一、小鼠重症急性胰腺炎模型的建立

二、胰腺组织髓过氧化物酶(MPO)测定

三、正电子发射显像(PET)体内观察胰腺F-18-FDG吸收率变化

三、统计学方法

结果

一、PS-341治疗后胰腺组织中MPO活性改变

二、MicroPET检测胰腺组织18F-FDG吸收率改变

讨论

参考文献：

结论

不足及展望

急性胰腺炎治疗研究的进展

急性胰腺炎的外科治疗

重症急性胰腺炎死亡相关因素分析

附表

在学期间(硕博连读)共发表文章

致谢