大鼠化学诱导性结肠炎模型的建立及云母干预治疗机制探讨

摘要

溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis，UC)主要临床表现为反复发作的腹痛、腹泻、粘液脓血便等，病变多累及直肠和乙状结肠。UC在欧美国家发病率高，我国的发病率正急剧上升。由于UC病因不明且治疗困难，给社会生产力和个人生活质量带来极大影响，引起了各国高度重视，是当今国际消化病诊治研究的热点。 有报道显示在我国70.2％UC患者为局限性的直肠乙状结肠炎，对该类患者的治疗主要以灌肠为主。灌肠可以使药物直接和病变部位接触并减少药物的全身副作用。目前用于灌肠的药物主要有5-氨基水杨酸(5-AminosalicylicAcid，5-ASA)和各种糖皮质激素，但5-ASA价格昂贵，且目前国内还未开发灌肠剂型；糖皮质激素灌肠后仍有较多患者出现全身副作用，研究高效安全且价格合适的灌肠成品有极大的意义。 云母是硅酸盐类矿物药之一，古代医家认为云母有“生肌敛疮”、“补中”、“主下痢”等功用，其药用价值在我国历史悠久，很可能云母灌肠对UC有效。 选择和建立合适的动物模型是研究UC药物治疗不可缺少的重要方法。UC的动物模型虽然有众多研究，但至今尚不理想。化学诱导性结肠炎是比较广泛采用的UC模型，包括葡聚糖硫酸钠(DextranSulfatesoduium，DSS)及2，4，6-三硝基苯磺酸(TrinitrobenzeneSulfonicAcid，TNBS)诱导性结肠炎模型。DSS诱导性结肠炎主要在结肠远端，其病理表现符合UC的特点，但是这个模型的一个很大的障碍是DSS非常昂贵。TNBS诱导性结肠炎模型是一种经典的炎症性肠病模型，诱导后产生的远端结肠病变持续存在，有许多学者把TNBS诱导性结肠炎模型作为UC的模型。 为了验证云母灌肠对结肠炎的治疗作用，我们首先建立起两种动物模型并对其疗效进行双重验证。我们重复了经典的TNBS诱导性结肠炎，并尝试建立了一种新的复合型大鼠DSS/乙醇化学诱导性结肠炎模型。将雌性SD大鼠随机分为4组，A组为模型组，B组和C组为阳性对照组，D组为正常对照组。A组和B组的大鼠自由饮用2％DSS3天，C组和D组的大鼠自由饮用消毒后的自来水3天。第4天，A组和B组的大鼠分别灌肠内注入0.5ml30％乙醇或生理盐水，C组和D组分别结肠内灌注0.5ml30％乙醇或生理盐水。各组进行疾病活动指数的评分，同时在结肠注入乙醇或生理盐水后24小时、3天、7天、14天和21天随机处死每组大鼠各5只进行大体评分和病理评分；结果显示模型组大鼠自由饮用2％DSS3天后灌肠注入30％乙醇可以诱导出现类似UC的体重下降、腹泻和血便。大体可见远端结肠有溃疡和炎症，病理显示炎症细胞侵润、隐窝脓肿和异型增生等UC的的病理特点。和正常对照组相比，模型组大鼠的体重明显减少，结肠的大体和病理积分增加；该模型和人类UC具有类似的临床和形态特点，且相对价格便宜、制作简单。 我们先以云母灌肠治疗大鼠DSS/乙醇化学诱导性结肠炎来确认云母的治疗作用。正常对照组、DSS/乙醇模型组、云母治疗组、5-ASA治疗组在制模的当天开始灌肠用药，连续用药10天。观察治疗前后大鼠体重的改变和治疗后大鼠结肠的大体和病理积分。云母或5-ASA灌肠治疗DSS/乙醇结肠炎后大鼠体重减少的情况有明显改善，同时大体积分明显减少，病理积分也同样明显减少。通过该部分研究明确了云母灌肠治疗DSS/乙醇化学诱导性结肠炎有效。 然后进一步在TNBS诱导性结肠炎模型上进行量效研究。TNBS诱导性结肠炎模型建立的当天分别给予低剂量云母(240mg/kg/d)、中剂量云母(480mg/kg/d)、高剂量云母(960mg/kg/d)和5-ASA(360mg/kg/d)灌肠。用药14天后，比较大鼠治疗前后体重改变情况和结肠的大体、病理积分；结肠灌注不同剂量的云母可以剂量相关地改善TNBS诱导性结肠炎大鼠的体重减少现象，同时减少大鼠结肠的大体和病理积分。该部分研究提示云母治疗结肠炎有量效关系。 为了进一步探讨云母起效的可能机制，我们接着对云母作用的体内和体外机制进行深入的研究。过度的免疫反应是UC炎症和组织损伤的内在重要因素，而细胞因子在调节肠道免疫反应中扮演重要角色，与UC的发生及转归密切相关。与UC发病有关的细胞因子主要有TNF-a(TumorNecrosisFactor-α，TNF-α)，IL-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-8等。我们采用大鼠TNBS诱导性结肠炎模型在体内水平深入研究了云母灌肠治疗后大鼠结肠局部TNF-α、IL-1β的基因和蛋白的改变情况。TNBS大鼠结肠炎模型制模的当天随机分组，分别给予低剂量云母、中剂量云母、高剂量云母和5-ASA灌肠。用药14天后，PT-PCR检测结肠组织中TNF-α、IL-1β、粘蛋白2(Mucin2，MUC2)和肠三叶因子(IntestinalTrefoilFactor，ITF)的mRNA含量。ELISA方法检测结肠组织中TNF-α、IL-1β蛋白含量，免疫组化和AB-PAS(Alcianblue/periodicacid-Schiffreaction)染色检测粘蛋白分布情况。结果显示TNBS诱导性结肠炎大鼠的结肠组织中TNF-α、IL-1β的mRNA和蛋白水平均明显增加，云母和5-ASA灌肠可以减少结肠炎大鼠结肠中TNF-α、IL-1β的mRNA和蛋白量。同时还发现TNBS诱导性结肠炎大鼠结肠中MUC2mRNA明显下降，云母和5-ASA灌肠治疗后有所上升。但是，各组结肠中ITFmRNA无明显改变。该部分研究提示云母灌肠治疗可以明显降低TNBS诱导性结肠炎局部的TNF-α、IL-1β的mRNA和蛋白水平。 最后采用THP-1和HT-29两种细胞株TNF-α、IL-1β和IL-8三种细胞因子的标准品在体外研究了云母对这三种细胞因子的作用情况。ELISA方法检测云母对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后的THP-1和HT-29两种细胞株分泌的细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-8的影响情况。ELISA方法检测不同剂量的云母和TNF-α、IL-1β及IL-8三种标准品共同孵育1小时后这三种细胞因子的变化情况。结果显示云母可以剂量依赖性地减少THP-1细胞株分泌的TNF-α、IL-1β和HT-29细胞株分泌的IL-8蛋白含量。TNF-α、IL-1β及IL-8这三种细胞因子的标准品在和云母共同孵育1小时后都有明显的剂量依赖性的下降。 通过上述实验，我们成功建立一种新的符合人类UC的大鼠化学诱导性结肠炎模型；明确了云母灌肠对两种化学诱导性结肠炎的治疗作用并摸索出量效关系。云母治疗作用机制与降低肠道局部的TNF-α、IL-1β的mRNA和蛋白有关，云母能吸附肠道各种细胞所释放的细胞因子可能是其起效的机制之一。

目录

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致谢

前 言

第一部分两种大鼠化学诱导性结肠炎模型的建立

1、三硝基苯磺酸诱导性结肠炎大鼠模型的建立

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

2、一种新的化学诱导性结肠炎大鼠模型的探索

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

3、结论

第二部分云母灌肠对两种大鼠化学诱导性结肠炎的治疗作用

1、云母灌肠对大鼠葡聚糖硫酸钠／乙醇化学诱导性结肠炎的治疗作用

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

2、云母灌肠治疗大鼠三硝基苯磺酸诱导性结肠炎的量效分析

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

3、结论

第三部分云母治疗结肠炎作用机制的体内和体外研究

1、云母对大鼠三硝基苯磺酸诱导性结肠炎作用机制的体内研究

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

2、云母对HT29和THP-1细胞系炎性细胞因子的作用研究

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

3、云母对炎性细胞因子标准品的体外吸附试验

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

4.结论

第四部分全文总结

参考文献

粘蛋白2、肠三叶因子与炎症性肠病

发表论文一

发表论文二

发表论文三

发表论文四

发表论文五

作者简历及研究生期间发表论文情况