硼替佐米对人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1作用的实验研究

摘要

目的： 骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一组异质性造血干细胞克隆性疾病。以骨髓病态造血为特征，进行性、难治性外周血红细胞、粒细胞及血小板减少为主要临床表现。尽管传统的对症支持、化学疗法、激素和细胞因子治疗，近年来出现的多种新型药物，如免疫调节剂和诱导分化剂等，能够缓解疾病，延长患者的生存期，但目前本病仍缺乏有效的根治方法，又具有向白血病转化的高风险，故近年WHO分型已将MDS归类为髓系造血系统恶性疾病。硼替佐米(Bortezomib，PS-341)是丙氨基酸硼酸衍生物的一种，为新型蛋白酶体抑制剂，因其独特的抗肿瘤机制，临床已经广泛用于多发性骨髓瘤和其他系统恶性肿瘤的治疗。但是目前国内外有关PS-341对MDS细胞的作用罕见报道。本实验旨在研究PS-341对人MDS细胞株MUTZ-1的作用并初步探讨可能的作用机制，为临床治疗提供实验依据。 方法： 1.采用MTT比色法检测PS-341对人MDS细胞株MUTZ-1体外生长的抑制作用。 2.瑞氏-姬姆萨(Wright-Giemsa)染色，油镜下观察细胞形态。 3.应用流式细胞仪，AnnexinⅤ和PI双染色，分析检测细胞凋亡。 4.Western-blot方法检测PS-341对MUTZ-1细胞凋亡相关蛋白PARP和Caspase-3蛋白表达的影响。 5.Western-blot方法检测PS-341对MUTZ-1细胞Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1和Bax蛋白表达的影响。 6.采用MTT比色法检测PS-341作用下，MUTZ-1细胞株对三氧化二砷的敏感性交化。 结果： 1.PS-341抑制MUTZ-1细胞的生长，呈浓度和时间依赖性： MTT比色法检测结果显示，0～160 ng/ml PS-341处理MUTZ-1细胞24小时、48小时、72小时，能够明显抑制MUTZ-1细胞增殖，各组间差异显著(P值均小于0.01)。且生长抑制率与药物作用浓度呈正相关(P<0.01)。PS-341处理细胞24小时、48小时、72小时后，MUTZ-1的IC50分别各为56.1ng/ml；34.2ng/ml；24.3ng/ml. 2.PS-341诱导MUTZ-1细胞凋亡，呈浓度依赖性： 采用瑞氏-姬姆萨染色，油镜下观察PS-341作用前后MUTZ-1细胞形态学变化，结果显示，20～80ng/ml的PS-341处理24小时后，MUTZ-1细胞出现典型的凋亡形态学特征，如胞浆空泡化，细胞体积缩小，细胞核染色质凝聚、边缘化，形成新月型核或环形核，细胞核碎裂，凋亡小体形成等。以流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量及磷脂酰丝氨酸(PS)转位。PI的DNA染色结果显示，0～80ng/ml的PS-341作用24小时，AnnexinⅤ-PI双标记法结果显示：以PS-341不同浓度20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml处理MUTZ-1细胞24小时，结果显示，0～80ng/ml的PS-341处理MUTZ-1细胞24小时，早期凋亡细胞百分数分别为：15.3％，21.8％，35.4％(空白对照组为2.3％)，晚期凋亡细胞百分数分别为：20.4％，30.3％，36.7％，早期细胞凋亡率与药物作用浓度呈正相关(r=0.986，P<0.01)。 3.PS-341诱导Caspase-3依赖型MDS细胞凋亡： 20～80ng/mlPS-341作用MUTZ-1细胞12小时后，Caspase-3和PARP蛋白都出现明显的激活带，光密度扫描显示，Caspase-3和PARP蛋白激活带表达水平与PS-341作用浓度存在正相关。提示PS-341通过激活Caspase-3途径诱导MDS细胞凋亡。 4.PS-341通过影响Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白的表达诱导MDS细胞凋亡： 20～80ng/ml PS-341作用MUTZ-1细胞12小时后，Bcl-2、Mcl-1表达水平显著下调，Bax表达水平上调，光密度扫描示，Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达水平与PS-341作用浓度存在负相关，Bax蛋白表达水平与PS-341作用浓度呈正相关，提示PS-341可能通过改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表达比例，促使细胞色素C等多种凋亡因子的释放，诱导MDS细胞凋亡。 5.PS-341增强MUTZ-1细胞对三氧化二砷的敏感性： 分别单独及联合以PS-3410～80ng/ml，As2O30.25～2μmol/L处理MUTZ-1细胞24小时，MTT比色法测定抑制率。结果显示，在一定浓度范围内，PS-341与As2O3联用效果优于单用，且细胞抑制率与药物浓度呈正相关。 小结： 1.在体外，PS-341可直接抑制MDS细胞株MUTZ-1细胞的生长，并呈浓度和时间依赖性； 2.20～80ng/ml PS-341处理一定时间后可明显诱导MUTZ-1细胞凋亡，并呈浓度依赖性； 3.PS-341诱导Caspase-3依赖型MDS细胞凋亡，并呈浓度依赖性。 4.PS-341能下调Bcl-2和Mcl-1蛋白的表达水平，同时上调Bax蛋白的表达水平，改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的表达比例，诱导细胞凋亡。 5.PS-341能增强MUTZ-1细胞对三氧化二砷的敏感性，在一定浓度范围内与三氧化二砷有协同作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1引言

2材料与方法

2.1仪器、材料和试剂

2.2实验方法

3结果

3.1 PS-341对MUTZ-1细胞的生长抑制作用

3.2 PS-341诱导MUTZ-1细胞凋亡的检测

3.3 PS-341对MUTZ-1细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP蛋白表达的影响

3.4 PS-341对MUTZ-1细胞Bcl-2、Mcl-1、Bax蛋白水平的影响

3.5蛋白酶体抑制剂PS-341增强MUTZ-1细胞株对As2O3的敏感性

4讨论

5结论

参考文献

综述：硼替佐米治疗恶性血液病研究进展

作者简历及在学期间发表的文章