家蚕中肠和培养细胞的蛋白质组学研究

摘要

利用双向电泳和基质辅助激光解析飞行时间质谱结合的蛋白质组学技术对家蚕5龄期不同发育时期的中肠蛋白质组进行了比较研究；通过多维液相色谱和串联质谱联用的蛋白质组学技术对5龄期第2天家蚕幼虫的中肠蛋白质组组成进行了分析，通过一维电泳、多维液相色谱分离技术以及串联质谱结合的方法对BmNPV感染前后的家蚕BmN培养细胞的蛋白质组组成进行了分析研究，对比它们之间的差异性。在此基础上通过生物信息学分析和分子生物学技术对通过蛋白质组学鉴定的2种抗病毒蛋白的分子生物学特征以及抗病毒活性进行了分析和研究。主要结果如下：
　　 1、对家蚕5龄期第2天、第5天和第7天的中肠组织蛋白质进行了2D电泳，建立不同时期标准的蛋白质参考图谱。利用ImageMaster2D Platinum对蛋白图谱进行分析，发现家蚕中肠蛋白质大多分布在pI值4-8、分子量20-70 kDa的区域。5龄期家蚕第2天的蛋白质斑点数目为869个，第5天为966个，新增蛋白数目97个，增加的蛋白主要分布在pI6-9，分子量20-40 KDa区间；进入幼虫成熟期（第7天）的蛋白质斑点数目明显减少，仅为420个，斑点数减少了56.5％。利用MALDI-TOF-MS对差异表达的部分蛋白质斑点进行鉴定，发现在5龄期初期和旺食期（第2天和第5天），表达量较大的蛋白主要是由家蚕中肠的肌肉层和上皮层的结构蛋白，与中肠消化和吸收功能相关的蛋白以及与家蚕细胞凋亡相关的蛋白组成，它们分别是肌动蛋白、胞质型肌动蛋白A3al、微管蛋白α-8链、角蛋白1、热激70 kDA蛋白类似物3、液泡性ATP合成酶催化单位A、硫醇抗氧化蛋白、AGL165Wp、精氨酸激酶等、血淋巴3nk蛋白（基因6G1）和主要血浆蛋白30 k等。这些蛋白大多数在家蚕5龄期末期表达量下降，甚至完全降解，除液泡性ATP合成酶催化单位A以外。液泡性ATP合成酶催化单位A表达量上升可能和家蚕中肠5龄期末期需要大量的能量降解家蚕中肠本身的组织蛋白，从而尽快消化失去生物功能的家蚕中肠组织有关。
　　 2、为了进一步详细解析中肠蛋白质组的组成并解释中肠的生物学功能,利用纳米液相色谱电喷雾串联质谱分析了家蚕中肠的蛋白质组，获得的质谱数据利用X!Tandem搜索软件通过不同的参数进行分析，并且通过泊松模型进行确认，最终共获得90个蛋白点。其中79个蛋白点被首次描述，发现22个蛋白点与中肠的消化功能密切相关，包括中肠上皮细胞分泌的11种酶，肠壁肌肉所需要的8种驱动蛋白和防止食物摩擦肠壁受伤的3种围食膜蛋白；44种蛋白与物质和能量的代谢相关；11种蛋白与信号转换、物质运输以及细胞骨架相关。
　　 3、利用一维SDS凝胶电泳和串联质谱连用的方法研究家蚕培养细胞BmN蛋白质组的组成，鉴定到1478种的蛋白质，通过GO分类注释发现，这些蛋白具有不同的等电点和分子量，含有多种不同的生物活性，像催化活性、结合活性、分子转导活性、动力活性、转录调节活性、酶调节活性以及抗氧化活性。利用相同的方法研究BmNPV感染后BmN培养细胞蛋白质组组成，鉴定的蛋白质数目为303个，通过对比发现，感染后新出现的特异蛋白点数目有8个，分别是微管蛋白β-1，脂肪酶，丝氨酸蛋白酶2，ICE-5蛋白，网格蛋白，鸟氨酸结合蛋白，凋亡蛋白激活因子以及另外一个未知的蛋白。在这些蛋白中，网格蛋白、微管蛋白β-1和病毒的侵染途径有关；脂肪酶、丝氨酸蛋白酶以及鸟氨酸结合蛋白和抗病毒相关；而ICE-5蛋白、凋亡蛋白激活因子和家蚕BmN细胞凋亡相关，最后一种蛋白的功能未知。
　　 4、对上述发现的抗病毒蛋白进行了进一步分析，从中国家蚕和野蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因Lipase cDNA(GenBank AY945209和AY945212)。对野蚕中的抗病毒蛋白进行了重点研究。野蚕基因Lipase cDNA大小906 bp，编码301个氨基酸，蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其基因组全长，结果表明野蚕基因由2147 bp组成，包含4个外显子和3个内含子。分析了该基因在野蚕体内的活动规律，发现该基因的表达具有组织特异性，仅限于野蚕中肠组织表达；该基因在幼虫龄中表达水平较高，而在幼虫眠期和熟蚕内几乎没有表达。通过基因的体外表达获得重组蛋白Lipase，发现该蛋白能够有效抑制BmNPV病毒对家蛋的感染，说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。
　　 5、从野蚕中肠内克隆了抗家蚕BmNPV病毒的SP-2 cDNA(GenBank登录号：AY945210)，基因大小855bp，编码284个氨基酸的蛋白质，分子量29.6kDa，基因组全长1376bp，包含5个外显子和4个内含子。该基因的表达仅限于中肠，具有组织特异性，在幼虫龄中表达水平较高，而在眠期和熟蚕没有表达。推导其氨基酸序列，发现其C端氨基酸序列与已报道的家蚕相应序列差别较大，有8个氨基酸完全不同。通过体外重组技术，由高效基因表达系统获得大量重组蛋白，发现该蛋白具有很强的抗家蚕BmNPV活性，与家蚕对应的抗病毒蛋白BmSP-2相比，其抗BmNPV活性高1.6倍。初步认为，该蛋白质C端序列差异可能是造成家蚕与野蚕抗病毒活性差别的主要原因。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 文献综述

一、家蚕蛋白质组学的研究现状

二、本研究的目的及其科学意义

第二部分 研究内容

第一章 家蚕中肠和培养细胞的蛋白质组学研究

一、家蚕中肠蛋白质组学研究

二、家蚕中肠蛋白质组学的组成分析

三、家蚕培养细胞BmN的蛋白质组学研究

第二章 基于蛋白质组学研究发现的抗病毒蛋白质基因研究

一、野蚕抗病毒蛋白Lipase的基因克隆与活性分析

二、野蚕抗病毒蛋白SP-2的基因分析和活性鉴定

研究小结

附录A 本论文内应用的数据库网站

附录B 本论文的英文缩写

致谢

攻读硕博期间发表的论文