慢性乙肝患者调节性T细胞、黏附细胞对HBV特异CTL细胞体外增殖的影响

摘要

[背景和目的]: 乙型肝炎病毒是非直接致细胞病变、嗜肝性DNA病毒，可引起多种肝脏疾病。全世界慢性HBV感染者约有4亿人，每年有超过100万人死于HBV感染的相关疾病。目前一致认为，机体细胞免疫应答的程度，特别是细胞毒性T淋巴细胞( cytotoxic Tlymphocytes，CTL)的功能，直接影响着感染的转归。慢性HBV感染者特异CTL细胞功能下降与调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)和黏附细胞(adherent cell，AC)有密切的关系，Treg是一类具有免疫抑制作用的T细胞亚群，在慢性感染性疾病中起着重要的免疫抑制作用。AC主要是一类具有抗原提呈作用的细胞，慢性HBV感染者伴有AC抗原提呈功能下降。目前认为Treg可能抑制了HBV特异CTL细胞的功能，但具体机制仍不清楚，因此探明慢性HBV感染者特异CTL细胞免疫调控机制，对于乙肝的治疗起着关键作用。本实验利用AC贴壁生长的特性及磁性细胞分离技术(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)，建立Treg、AC、CTL细胞相互作用的模型，以主要组织相容性复合物一抗原肽四聚体(MHC-肽四聚体，Tetramer)流式细胞技术为核心的HBV特异CTL实验技术为基础，通过体外诱导刺激，探讨慢性HBV感染者Treg、AC对HBV特异CTL细胞体外增殖的影响，为重新恢复HBV特异CTL细胞的功能，打破HBV感染免疫耐受状态，提供新的理论支持，并为寻求新的抗病毒治疗策略提供启发和借鉴。 [对象和方法]: 1.研究对象 筛选2008年2月～2008年12月在浙江大学附属第一医院感染科门诊和住院HLA-A2阳性的慢性HBV感染者56例(因针对HBV核心抗原18-27表位的特异性CTL反应是受HLA-I类分子限制的，所以筛选HLA-A2阳性病人作为研究对象)，诊断符合2005年12月由中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》，同时以10例HLA-A2阳性的正常健康人为对照组，结合临床资料分为A、B、C三组，具体分组情况如下： A组：慢性乙型肝炎患者，共31例，男23例，女8例，年龄19～65岁，平均年龄42.8±11.9岁。其中16例用于细胞刺激培养方法的建立，余15例用于细胞相互作用模型的建立。 B组：慢性无症状HBV携带者，共25例，男17例，女8例，年龄16～50岁，平均年龄40.6±9.4岁。其中13例用于细胞刺激培养方法的建立，余12例用于细胞相互作用模型的建立。 C组：正常对照组，HLA-A2阳性的健康人10例，设为正常对照组，其中男6例，女4例，年龄23～62岁，平均年龄40.4±12,1岁，用于细胞刺激培养方法的建立。 2.实验方法 (1)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分离空腹静脉采集全血标本，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC。 (2) HLA分型技术采用流式细胞技术快速检测HLA-A2抗原分型。 (3)细胞刺激培养方法的建立分离后的PBMC悬液加HBcAg、HBV core18-27抗原肽段在5％ C02、37℃湿润条件下培养2天，第三天以HBcAg、HBV core18-27抗原肽段、IL-2培养基换液，以后每两天按此培养基半量换液一次，第11天收集悬浮细胞，用4℃PBS缓冲液洗涤两遍，制成细胞悬液，流式细胞检测。 (4)细胞相互作用模型的建立首先采用MACS磁分选技术分离CD4+CD25+Treg细胞，再将不含有CD4+CD25+Treg的PBMC贴壁2h，吸取悬浮细胞(此即为无Treg、无AC的PBMC)并获得AC。Treg分成两份，AC分成两份，将无Treg、无AC的PBMC平均分成四份，加到上述的四份细胞中，这样就获得有Treg、有AC的PBMC(模式一，记为M1)，无Treg、有AC的PBMC(模式二，记为M2)，有Treg、无AC的PBMC(模式三，记为M3)，无Treg、无AC的PBMC(模式四，记为M4)，上述四种模式的PBMC分别加HBcAg、HBV core18-27特异肽段、IL-2共同刺激，在5％ CO2、37℃湿润条件下培养11d后测定四聚体阳性(即CD8+Tetramer+)细胞频数。 (5) Tetramer流式细胞技术测定PBMC中HBV特异CTL采用藻红蛋白(PE)标记的MHC-肽四聚体(Tetramer)和荧光色素(FITC)标记的anti-CD8+，通过双色标记流式细胞技术检测针对HBV Core18-27表位的特异性CD8+T细胞，并以针对HCV C区178-187表位的Tetramer作为对照。计数50000个CD8+细胞，同时计数CD8+和Tetramer+双阳性细胞为HBV特异性CD8+细胞，并以占总计数CD8+细胞的百分比表示。 (6) HBV病毒学指标的检测HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe及抗HBc采用微粒子酶联免疫法(MEIA)检测；HBV-DNA定量采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测，截止值为103拷贝/ml。 (7)血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定使用HITACHI7600-110型全自动生化分析仪测定。 (8)数据的统计学处理采用SPSS13.0统计软件中的相关方法。 [结果]: 1.慢性乙肝患者组、慢性无症状HBV携带者组与正常对照组刺激前CD8+Tetramer+细胞频数均小于0.1％，刺激培养11d后，慢性乙肝患者组CD8+Tetramer+平均频数为0.99±0.44％，慢性无症状HBV携带者组CD8+Tetramer+平均频数为0.88±0.42％，均较刺激前增加，有统计学差异(P<0.01)。刺激培养后慢性乙肝患者组与慢性无症状HBV携带者组CD8+Tetramer+频数比较没有统计学差异( P=0.67)。健康对照组刺激后CD8+Tetramer+频数仍小于0.1％，与刺激前没有统计学差异。 2.慢性乙肝患者组(A组)与慢性无症状HBV携带者组(B组)Treg、AC、CTL细胞相互作用结果 (1)有Treg、有AC时(M1)，CD8+Tetramer+平均频数A组为0.40±0.17％，B组为0.36±0.21％；两者相比无统计学差异(P>0.05)。 (2)无Treg、有AC时(M2)，CD8+Tetramer+平均频数A组为0.69±0.28％，B组为0.73±0.37％；两者相比无统计学差异(P>0.05)。 (3)有Treg、无AC时(M3)，CD8+Tetramer+平均频数A组为1.31±0.51％，B组为1.38±0.47％；两者相比无统计学差异(P>0.05)。 (4)无Treg、无AC时(M4)，CD8+Tetramer+平均频数A组为1.75±0.64％，B组为1.72±0.55％；两者相比无统计学差异(P>0.05)。 3.慢性乙型肝炎患者组，不同模式间CD8+Tetramer+平均频数比较 (1) M1、M2、M3均低于M4，有统计学意义(P<0.01)； (2) M1、M2均低于M3，有统计学意义(P<0.01)； (3) M1低于M2，有统计学意义(P<0.01)； (4)M2低于M3，有统计学意义(P<0.01)。 [结论]: (1)采用IL-2、HBcAg、HBV core18-27抗原肽共同刺激培养，可以提高HBVcore18-27特异CTL细胞的数量。 (2)刺激培养后慢性乙型肝炎患者组与慢性无症状HBV携带者组外周血抗原特异性CTL水平增殖无明显差异。 (3)不管AC存在与否，Treg均可抑制CTL细胞的增殖 (4)不管Treg存在与否，AC均可抑制CTL细胞的增殖。 (5)Treg与AC同时存在时，其抑制CTL细胞增殖的能力大于它们单独作用。 (6)在慢性乙肝中，AC抑制CTL细胞增殖的能力大于Treg。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩写注释表

声明

致谢

1前言

2材料与方法

2.1临床资料

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4统计学处理

3结果

3.1 HLA-A2分型结果

3.2刺激培养前后，CD8+Tetramer+频数测定

3.3 Treg、AC、CTL细胞相互作用结果

4讨论

5结论

参考文献

综述 CD4+CD25+Treg细胞在慢性乙型肝炎发病机制中的作用

作者简介