基于问号钩端螺旋体rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合抗原ELISAs的建立及应用

摘要

背景和目的:钩端螺旋体(简称钩体)病是问号钩体(Leptospira interrogans)感染引起的全球性流行人兽共患传染病。目前钩体病血清学诊断方法主要是显微镜凝集试验(microscope agglutination test，MAT)，该方法虽有较高特异性，但存在操作繁复、敏感性低、不能早期诊断及高通量检测等缺点。此外，MAT需采用问号钩体新鲜培养物作为凝集原，也存在安全性问题。有文献报道，问号钩体穿膜蛋白OmpL1、外膜脂蛋白LipL21和LipL32均是问号属特异性表面蛋白抗原，均能诱导机体产生特异性抗体，故有可能作为通用型钩体病血清学诊断方法的抗原。最近，本实验室成功地构建了lipL32/1-lipL21-ompL1/2人工融合基因并表达了其产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2。实验表明rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2具有良好的抗原性和交叉免疫反应性，可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。为了建立敏感、特异和通用的钩体病血清学诊断方法，本研究建立以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为包被抗原、用于检测特异性血清IgG和IgM的ELISAs，并对其检测钩体病人血清标本的效果进行了考核。 实验方法:采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量。采用免疫双扩散试验及Western Blot鉴定rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2的免疫原性。采用显微镜凝集试验(MAT)检测钩体病人血清及rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国问号钩体参考标准株的效价。分别以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2为包被抗原，建立检测血清特异性IgM和IgG的ELISAs并用于检测107份MAT阳性钩体病人血清标本。 结果:rLipL32/1-LipL21- OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染病人血清出现阳性杂交信号。MAT结果证实，66％(71/107)病人感染黄疸出血群问号钩体，rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国15株问号钩体参考标准株的凝集效价为1∶20～1∶160。rLipL32/1- LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2抗原用于检测107例钩体病人血清特异性IgM的ELISA阳性率分别为89.7％、75.7％、85.1％和79.4％，用于检测特异性IgG的ELISA阳性率分别为99.1％、99.1％、94.4％和86.0％。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-IgM-ELISA检测阳性率高于其它三种检测IgM的ELISAs(P＜0.05)，rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-lgG-ELISA检测阳性率高于rOmpL1/2- IgG-ELISA(P＜0.05)，但与rLipL21-IgG-ELISA及rLipL32/1-IgG-ELISA接近(P＞0.05)。 结论:rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2具有良好的抗原性和交叉免疫反应性，可作为通用型钩体病血清学检测的抗原。rLipL32/1-LipL21- OmpL1/2为抗原的ELISAs是敏感、特异、简便、相对高通量的通用型钩体病血清学早期诊断方法。

目录

文摘

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致谢

前言

第1章目的重组蛋白浓度测定及rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2抗血清制备及其效价测定

1.1主要仪器和试剂

1.2方法

1.3结果

第2章目的重组蛋白Westerblot试验

2.1主要仪器和试剂

2.2操作步骤

2.3方法

2.4结果

第3章显微镜凝集试验

3.1主要仪器与试剂

3.2菌株来源

3.3血清标本来源

3.4方法

3.5结果

第4章基于问号钩端螺旋体rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2融合抗原ELISAs的建立及应用

4.1主要仪器和试剂

4.2方法

4.3数据处理

4.4结果

第5章讨 论

参考文献

综述　问号钩端螺旋体蛋白研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果