大黄鱼头肾SSH cDNA文库构建及两个重要生理功能分子(BPI、DP1)的生物学特征和功能研究

摘要

大黄鱼是我国近海特有的主要经济鱼类和当前最主要海水养殖鱼类之一，目前关于大黄鱼的基础免疫学和生理学方面的研究还比较少。为了获得涉及大黄鱼的基础免疫学和生理学方面的重要的差异表达基因，本研究以肽聚糖为免疫刺激剂，用抑制性差减杂交技术(SSH)构建了大黄鱼受肽聚糖刺激后头肾差异表达基因的cDNA文库，并结合RACE-PCR技术对其中2个重要生理功能的分子(BPI、DP1)进行了克隆鉴定及生物学特征和功能研究。本研究取得的主要结果包括3个方面：
　　 1 cDNA文库分析结果
　　 在构建好的cDNA文库中，随机挑取克隆测序得到196个EST，组装后得到149个unique gene, GenBank编号为EB643250-EB643371和GO271613-GO271637，其中26个有明确的注释，根据其功能和作用可以被分为10类，其中5个与免疫反应相关，3个线粒体基因，3个信号转导分子，5个蛋白激酶类分子，2个癌基因，2个微卫星基因，2个细胞骨架基因，1个RNA水平相关因子，1个雄性不育基因和1个核糖核蛋白。2大黄鱼杀菌通透增强蛋白Pc-BPI的生物学特征和功能研究
　　 该基因cDNA全长为1919 bp（GenBank序列号：DQ917778），开放阅读框长1419 bp，编码472个氨基酸。大黄鱼Pc-BPI的氨基酸序列与其他物种的同源物的相似性为25-36％。在Pc-BPI的N末端(5.02e-31)和C末端(1.93e-32)分别包含一个典型的哺乳动物BPI/LBP/CETP的结构域。
　　 Pc-BPI在正常大黄鱼各组织中为普遍性表达，在鳃、脾、头肾中的表达量比其它被检组织表达高，其表达水平可被福尔马林灭活的诺卡氏菌(FI-Ns)和福尔马林灭活的溶藻弧菌(FI-Va)诱导。
　　 表达了大黄鱼Pc-BPI基因的N末端和C末端的原核重组蛋白(rBN、rBC)，和Pc-BPI全蛋白的真核表达产物(rBO)。rBN有强烈杀灭哈维氏弧菌的作用，对从患病海水养殖鱼类中分离到的溶藻弧菌和副溶血弧菌也能有效杀灭。
　　 制备了针对rBN的兔抗血清，免疫组化研究显示，Pc-BPI的表达在肾组织中的阳性反应较弱，而脾和头肾组织中阳性反应强烈，且主要在各组织细胞的实质性细胞和脾脏血窦的内皮细胞及肾小管的上皮细胞的细胞质中进行表达，在实质性细胞的细胞核中也有轻度的表达。3大黄鱼重要的生理功能分子——转录因子Pc-DP1的生物学特征和功能研究
　　 克隆和表达了大黄鱼重要的生理功能分子——转录因子Pc-DP1(GenBank序列号：DQ821446)。其cDNA全长1427 bp,具有一个1239 bp的读码框，编码412个氨基酸。大黄鱼Pc-DP1蛋白是一个结构和功能上都非常保守的蛋白，Pc-DP1的氨基酸序列与斑马鱼的DP1的相似性最高(88％)，与爪蟾、人和鼠的相似度均为78％。Pc-DP1氨基酸序列中包含一个典型的保守DNA结合区域(113-148)和一个与E2F亚家族蛋白结合为二聚体的区域(149-209)。大黄鱼Pc-DP1蛋白的N端多为碱性氨基酸，而C端多为酸性氨基酸。
　　 Pc-DP1的mRNA在所检测的各组织中均有表达，在心脏、脾脏和肠中表达量相对较高，在头肾中表达量最少。Pc-DP1在大肠杆菌中高效表达，并制备了针对该重组蛋白的兔抗血清。EMSA实验结果表明，该重组蛋白具有一定的DNA结合能力，且这种结合能力具有序列特异性。免疫组化结果表明，阳性反应主要发生在脾、头肾、肾的实质性细胞的细胞质里和鳃丝的上皮细胞的胞质中。

目录

文摘

英文文摘

引言

缩略语

第一部分 文献综述及研究内容和技术技术路线

第一章 抗菌肽研究进展

1 引言

2 抗菌肽的分布和分类

3 抗菌肽的生物学特性及机理

4 结束语

第二章 BPI的国内外研究进展

1 引言

2 BPI的发现

3 BPI的表达和调控

4 BPI和LBP

5 BPI与免疫的关系

6 BPI和ANCA

7 BPI在医学上的应用研究

8 BPI的重组表达和临床应用研究

9 BPI在水生动物的研究进展

10 结束语

第三章 E2F家族的研究进展

1 引言

2 E2F家族的发现、组成及结构

3 E2F的功能

4 展望

第四章 研究内容及技术路线

1 研究内容

2 技术路线

第二部分 大黄鱼SSH cDNA文库构建

第五章 大黄鱼受肽聚糖(P G)刺激后头肾SSH cDNA文库的构建

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分大黄鱼杀菌通透增强蛋白Pc-BPI的生物学特征和功能研究

第六章 Pc-BPI基因的克隆鉴定以及病原菌刺激后的表达分析

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第七章 Pc-BPI基因的蛋白表达纯化、生物学活性和功能研究

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第八章 Pc-BPI蛋白的组织细胞定位研究

引言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四部分大黄鱼重要的生理功能分子-转录因子Pc-DP1的生物学特征和功能研究

第九章 大黄鱼DP1的克隆和表达分析

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第十章 Pc-DP1基因的原核表达、蛋白质活性分析以及组织细胞定位研究

引言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

全文小结

1 本研究的主要结论

2 本研究主要的创新点

3 进一步研究方向

参考文献

个人简历

附录 攻读博士学位期间发表的学术论文及专利

致谢