新的T细胞活化标志ZCH-2B8a抗原的分子特性及功能研究

摘要

目的：ZCH-2B8a单克隆抗体由本研究室采用经典的杂交瘤技术制备而成，经HLDA8协作组鉴定后认为属国际上尚未认识的造血细胞膜新的分化抗原或新的CD分子，前期研究表明该抗原(Ag)可能为一活化分子。因此有必要对该Ag进一步研究以明确该其蛋白序列及其表达谱、是否为一新的活化分子及它的功能，开发其潜在的应用价值。 方法：本研究主要包括以下四部分： (1)制备2B8aFITC直标抗体：采用SPASepharose亲和层析法从腹水中纯化2B8a抗体；聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定抗体纯度及分子量；采用改良Marshall法制备2B8aFITC直标抗体，并通过流式细胞术鉴定。 (2)检测2B8aAg的分布情况：采用流式细胞术检测2B8aAg在外周组织、正常外周血、白血病细胞、细胞株上的分布；采用激光共聚焦显微镜观察2B8aAg在细胞上的定位。 (3)2B8aAg的功能研究：通过流式细胞术检测PHA刺激后T细胞活化过程中2B8a的表达规律；检测再生障碍性贫血等病人外周血标本2B8aAg的表达情况及与其他活化标志的相关性；利用流式细胞微球技术(CBA)检测2B8aAb对活化T细胞分泌细胞因子的影响；通过2B8a抗体封闭Raji细胞的Ag表位检测它与骨髓基质细胞粘附能力的变化；通过木瓜酶酶切法结合流式细胞术检测2B8aAg介导抗体内化的能力；通过补体依赖的细胞毒实验(CDC)了解2B8aAb与Ag特异性结合及激活补体的能力。 (4)2B8aAg蛋白的鉴定：将Raji细胞蛋白裂解液经免疫共沉淀法纯化后行SDS-PAGE检测，胶上的Ag蛋白条带送肽质量指纹图及串联质谱分析；Westernblot法鉴定288aAg蛋白的分子量。 结果：经SDS-PAGE鉴定，288a抗体的重链和轻链分子量分别为52kDa和29kDa。288a直标法(288aFITC)和间标法(288a+GAM-FITC)与Raji细胞阳性反应率分别为98.48％和98.35％，与Molt-3细胞阳性反应率分别为9.35％和10.80％。288aAg在正常外周血的T细胞表面不表达(5.4±3.80/0)，B细胞表面弱表达(29.9±14.8％)，而中性粒细胞(92.2±8.7％)和单核细胞(81.9±19.3％)表面表达较强。在B系急性淋巴细胞白血病细胞表面，该Ag的表达较对照组显著增强(中位值99.0％vs.43.9％).该Ag在所检测B系、T系、髓系的外周血细胞和肿瘤细胞株的胞浆内呈高表达。288aAg在活化T细胞上的表达规律与CD69、CD25和HIA-DR不同，在T细胞受PHA刺激后12h内即可表达于胞膜上，72～96h达高峰。再生障碍性贫血(AA)等免疫相关疾病的T细胞表面，该Ag的表达明显上调(AA:CD4+T细胞阳性率90.9％，CD8+T细胞阳性率72.7％)。采用2B8a抗体封闭抗原表位后并不能减少Raji细胞与骨髓基质细胞的粘附(2h、4h、6h和12h时2B8a组与对照组的粘附率比分别为0.87、1.02、1.02和0.96，均为P＞0.05)，也并不影响T细胞活化后细胞因子的分泌水平和活化状态(PHA组与PHA+288a组IL-2中位值：425pg/mlvs.442pg/ml，P=0.465).与3A4抗体在37℃时才能逐渐内化不同，288a抗体在4℃和37℃均可以快速“内化”(288aFITC与Raji细胞4℃和37℃孵育5min后再行木瓜酶酶切，流式检测阳性反应率分别达到76.7土2.5％和89.2±1.5％).288a抗体能激活补体，介导CDC作用杀伤Raji细胞(按0.1μg抗体：10μl补体：5×104细胞的比例，Raji细胞死亡率88.6±7.9％)，而对Molt-3细胞基本无杀伤作用(死亡率3.6±0.6％)。将Raji细胞裂解液经免疫共沉淀纯化2B8aAg后，westernblot鉴定证实该Ag的分子量为50kDa左右。质谱分析未能明确得到唯一、可靠的蛋白序列，通过蛋白数据库比对及功能研究，冠蛋白的可能性较大，但它在表达谱上与288aAg仍有较大不同。 结论： (1)本研究自行研制的2B8aFITC荧光抗体具有良好的敏感性和特异性； (2)2B8aAg在淋巴结、扁桃体、肝脏及胰腺组织中可检测到；在外周血，它主要分布在活化T细胞、B细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞膜和细胞浆，而在静患T细胞膜上不表达，但在其胞浆中表达也很强； (3)2B8aAg是一个早期稳定的T细胞活化标志；在再生障碍性贫血等免疫相关疾病中表达上调； (4)2B8aAg可以介导抗体迅速内化； (5)2B8aAb能激活补体，发挥明显的CDC作用； (6)2B8aAg不能介导细胞间的粘附；对活化T细胞的细胞因子分泌无明显影响； (7)质谱分析未能在现有的蛋白质数据库中检索到与2B8aAg相匹配的蛋白，该抗原可能为一新的蛋白分子。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

致谢

序言

引言

第一部分ZCH-2B8a FITC直标抗体的制备

材料

方法

结果

讨论

小结

第二部分ZCH-2B8a识别抗原的分布

材料

方法

结果

讨论

小结

第三部分ZCH-2B8a识别抗原的功能研究

材料

方法

结果

讨论

小结

第四部分ZCH-2B8a识别抗原的蛋白鉴定

材料

方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

综述：T细胞活化分子的功能及临床研究进展

作者简历