传染性法氏囊病毒感染的生物标记与细胞SAGE文库的鉴定

摘要

传染性法氏囊病病毒(InfecTiO2s bursal disease virus，IBDV)属于双RNA病毒科、禽双RNA病毒属，分为血清I型和血清II型。血清I型对鸡有致病性，血清II型对鸡无致病性。IBDV基因组由双股RNA组成：A节段和B节段，编码5种蛋白。B节段有一个ORF，编码RNA依赖的RNA聚合酶(VP1)。A节段有两个ORF，大ORF编码病毒的VP2、VP3和VP4蛋白；小ORF编码VP5蛋白。IBDV发病机理不清是该病控制的难点。为此，本研究在转录组和体液免疫水平上对IBDV与宿主的相互作用进行了分析。
　　 首先，在转录组水平上，本研究分析了IBDV感染及IBDV编码基因转化对宿主Vero细胞基因转录的影响。以实验室已构建的5个Long-SAGE文库：正常Vero细胞文库、IBDV感染的Vero细胞文库、表达A节段编码蛋白的单克隆Vero细胞文库、表达VP243蛋白的单克隆Vero细胞文库、表达VP5蛋白的单克隆Vero细胞文库为基础，对文库中转录显著变化(P<0.05)的基因进行统计分析，发现217个可注释基因的转录发生显著变化。对差异转录基因进行聚类分析，发现蛋白质代谢、能量代谢、mRNA加工和细胞骨架相关基因转录变化最为显著。57个显著变化基因的荧光定量PCR验证结果显示，荧光定量PCR结果与文库数据的符合程度是60％-70％，确证了IBDV感染及IBDV编码基因Vero细胞SAGE文库大规模测序基因标签数据的正确性，这为IBDV的发病机制研究提供了大量的基因生物信息。
　　 以IBDV攻毒后的法氏囊组织和感染的鸡胚成纤维细胞RNA为模板，以IBDV感染Vero细胞的基因转录变化为线索，选取IBDV感染Vero细胞Long-SAGE文库中显著变化的15个基因和17个促炎性因子基因，设计鸡源引物，借助荧光定量PCR方法，分析了IBDV感染的法氏囊组织和鸡胚成纤维细胞的转录本变化。在IBDV感染的鸡胚成纤维细胞中，HMGN2的显著下调，推测与病毒感染细胞的细胞凋亡相关；促炎性因子表达普遍上调，其中β干扰素(IFN-β)转录本上调500倍以上，其他促炎性因子如IFN-G、BAFF、IL-6、IL-1B、IL.8和iNOS也上调20倍以上。在感染IBDV的法氏囊组织中，氯离子通道蛋白4(CLIC4)显著表达上调，推测与病毒的破膜释放相关；促炎性因子IL-6的转录上调1746倍。表达上调20倍以上的基因还有TNFSF8、IFN-B、IFN-G、TNFRSFlA、IL-8和iNOS。这些数据说明，IBDV感染导致不同类型宿主细胞基因变化的种类具有一致性，但变化的趋势具有不完全一致性，充分显示了不同类型细胞的易感差异性。
　　 在IBDV感染的法氏囊组织中，我们发现Cofilin基因转录显著上调，为分析Cofilin基因表达与IBDV感染之间的关系，本试验利用抗Cofilin蛋白抗体对IBDV感染的鸡胚成纤维细胞和法氏囊组织进行分析，结果发现IBDV感染能够激活Cofilin基因的表达。
　　 基于IBDV感染宿主细胞的转录本信息，为了了解宿主对IBDV非结构蛋白VP4的信号反馈，以重组表达的VP4、VP3蛋白为抗原，制备了抗VP4、VP3单克隆抗体和多克隆抗体，建立了VP4抗体检测ELISA。分析了IBDV强毒株(NB株，BC6/85株)、中等偏强毒力株（MB43株）、中等毒力株（B87株）、低毒力毒株(NB弱毒株)感染21日龄SPF Leghorn鸡的VP4蛋白的体液免疫应答，ELISA抗体监测结果显示：IBDV强毒感染鸡VP4抗体于感染后23天阳转，40天阳性率达70％以上，VP3抗体于感染后20天阳转，23天阳性率达到100％; IBDV弱毒疫苗一次免疫鸡难以检出VP4抗体，VP3抗体于20天阳转，23天阳性率达到88.9％。中等毒力IBDV感染后，VP4抗体阳性率为10％到40％，中等偏强毒力IBDV感染后VP4抗体阳性率为30％到60％。以IBDV VP3、VP4基因Vero细胞表达蛋白的IFA检测出现了类似的结果。对感染后血清VP4抗体效价测定发现，强毒感染血清VP4抗体效价与中等偏强毒力、中等毒力、弱毒相比较，具有显著差异。抗VP3、VP4单克隆抗体的免疫组织化学检测进一步显示：VP3、VP4抗原可以在IBDV强毒感染鸡法氏囊中检测到，而在弱毒疫苗感染鸡中只能检测到VP3抗原，难以检测到VP4抗原。这些数据证明VP4抗原及抗体是鉴别IBDV野毒与疫苗毒感染的生物标记。

目录

文摘

英文文摘

资助

论文创新点

研究意义

研究路线

第一部分 文献综述

第一章 传染性法氏囊病(IBD)

定义

简史

流行病学

抗原性及毒力变异

发病机理和临床症状

传染性法氏囊病的诊断

预防和控制

第二章 传染性法氏囊病病毒(IBDV)

分类

病毒结构和基因组结构

理化性质

病毒蛋白

IBDV的复制

第三章 传染性法氏囊病病毒宿主转录组学研究进展

Long-SAGE技术在IBDV宿主转录组学研究上的应用

基因芯片技术在IBDV宿主转录组学研究上的应用

其他病原宿主转录组研究进展

第二部分 研究内容

第一章 IBDV对宿主基因表达的影响

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 IBDV感染条件下Cofilin基因的表达变化

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 传染性法氏囊病病毒VP4、VP3蛋白单克隆及多克隆抗体的制备

摘要

l 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 不同毒力IBDV感染条件下鸡对VP4、VP3蛋白的免疫应答能力

摘要

l 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

第三部分 附录

缩写词索引

本研究所涉及基因的主要功能

常用试剂及仪器

常用缓冲液及培养基配方

致谢