环孢素A下调肿瘤特异性M2型丙酮酸激酶并抑制乳腺癌细胞的增殖

摘要

乳腺癌是女性多发的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率仅次于肺癌，目前传统的治疗方法如手术、放疗、化疗等常难以彻底消灭肿瘤细胞，又易损害机体的正常抗肿瘤免疫功能。因此，在传统的治疗方案中加以辅助手段使化疗药物用量减少，并提高其疗效有着重要的意义。环孢素A(CyclosporinA，CsA)作为一种经典的非细胞毒性免疫抑制剂被广泛用于器官和骨髓移植，随着对环孢素A研究的深入，它已经在几乎所有自身免疫或炎症反应相关的病理治疗中，发挥着重要作用。近期的研究发现CsA与肿瘤治疗关系密切，它可以作为P.糖蛋白的底物，从而竞争性抑制P.糖蛋白的功能，因此CsA已经被做为第一代多药耐药(MDR)调节剂使用，逆转抗肿瘤药物的多药耐药从而增强化疗药物的效果。如依托泊苷联合环孢素A能显著提高化疗药物在胞浆中的浓度，减少其被P一糖蛋白的清除，降低肿瘤细胞对依托泊苷耐药性。另外，CsA还是乳腺癌抵抗蛋白(BCRP)的抑制剂。近期研究发现CsA还可通过抑制NFAT通路，抑制致癌基因c-myc的活化而抑制肿瘤细胞的增殖。肿瘤细胞与正常细胞在代谢上的一个重要差别是，肿瘤细胞内生物大分子的合成非常活跃，糖酵解产物很少经过氧化磷酸化过程，大量中间产物被用于合成蛋白质、脂质等大分子，用于细胞的分裂增殖。在这个糖酵解能量供应以及细胞增殖所需大分子物质合成的平衡中，丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase isoenzyme typeM2，PKM2)是其糖酵解过程中的一个关键酶。丙酮酸激酶有四种同工酶(M1，M2，L和R)，PKM2是一种胚胎表型，它在分化过程中逐步被其他表型代替，但当成熟组织细胞从静息期重新进入细胞周期时，这些组织特异性丙酮酸激酶(PKM1，PKL，PKR)将被PKM2代替。肿瘤的发生是体细胞重新进入细胞周期并无限增殖的过程，在这个过程中PKM2大量表达代替原来的丙酮酸激酶正常表型，以维持其自身的高度增殖。研究表明(包括最近Nature上报道)，PKM2在肿瘤的异常代谢及肿瘤的发生发展中发挥着至关重要的作用。PKM2是一种有较好应用价值的肿瘤诊断以及疗效预后评价的标志物，也可能成为重要的抗肿瘤药物的靶点。
　　 本研究中，首次发现了CsA能显著下调乳腺癌细胞中肿瘤特异性M2型丙酮酸激酶(PKM2)的表达和活性，从而抑制乳腺肿瘤细胞的体外增殖和生长，诱导肿瘤细胞发生坏死，提示了CsA在乳腺癌的辅助治疗中可能具有潜在的应用价值。本研究分为两部分：第一部分：CsA抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞坏死用不同浓度CsA(5，10，15，20μg/ml)处理乳腺癌细胞株MCF-7，MDA-MB-435，MDA-MB-231和正常乳腺原代细胞，MTT法检测这些细胞的体外生长，结果显示CsA可以剂量和时间依赖方式抑制乳腺癌细胞的体外生长，其抑制效应明显高于对正常原代乳腺细胞的作用。CsA处理MCF-7细胞后，MCF-7中G1期细胞明显增多，而进入S期的减少，细胞周期阻滞于G1期。我们用流式细胞术检测Annexin-V和PI标记的CsA处理后的乳腺癌细胞，发现CsA并不明显诱导乳腺癌细胞发生凋亡，主要是直接诱导肿瘤细胞坏死。第二部分：采用荧光实时定量PCR技术检测了丙酮酸激酶在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞mRNA表达水平上的差异，用westem blot检测了PKM2在蛋白水平上的表达。结果显示，正常乳腺组织细胞的PKM2表达低而主要表达PKMI，肿瘤细胞则显示PKM2的高表达，而PKM1表达量较低。用不同浓度的CsA处理乳腺癌细胞株MCF-7，MDA-MB-435，MDA-MB-231以及正常乳腺原代细胞，荧光实时定量PCR检测PKM2的mRNA表达水平并用westem blot方法检测PKM2的蛋白水平，结果证实CsA能显著降低PKM2 mRNA和蛋白水平的表达。同时，用NP40裂解CsA处理的MCF.7细胞，检测其细胞裂解液中丙酮酸激酶活性也证明CsA能降低MCF-7细胞中PKM2的活性。丙酮酸激酶是糖酵解过程的关键酶，直接关系着ATP的产生。因此我们采用luciferase荧光检测法检测了CsA处理后细胞内ATP的含量，结果发现CsA处理后MCF-7细胞ATP产量减少。为了排除ATP产量的降低是由于线粒体功能受损，我们用JC-1荧光探针检测了CsA处理前后MCF-7细胞的线粒体膜电位，结果显示CsA处理后，MCF-7细胞线粒体功能并未受损，说明MCF-7细胞ATP产量的降低是由丙酮酸激酶活性降低引起。为了进一步证实PKM2是否为CsA抑制乳腺癌细胞增殖的作用靶点，构建了PKM2的真核表达载体PKM2-pEGFP-N1。该载体转染MCF-7细胞后，能高表达外源性PKM2，我们对转染后MCF-7细胞进行CsA处理并检测了其增殖和细胞周期，结果显示转染PKM2后，MCF-7对CsA药物处理的敏感性降低，而且可部分逆转CsA对MCF-7细胞的周期阻滞作用，与转染对照质粒的细胞相比，转染了PKM2质粒的MCF-7在CsA处理后阻滞于G1的细胞减少。上述结果提示CsA能通过降低PKM2表达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和生长。
　　 研究表明：⑴乳腺癌肿瘤细胞高表达胚胎型(M2)丙酮酸激酶(PKM2)，而正常乳腺细胞PKM2表达量低。⑵环孢素A能抑制乳腺癌细胞的体外增殖、诱导细胞周期阻滞，促其发生坏死。⑶环孢素A能抑制M2型丙酮酸激酶PKM2的表达，使其在细胞中活性降低，导致细胞内ATP的缺乏而造成细胞死亡。⑷外源转入PKM2可部分阻断CsA对乳腺癌细胞生长的抑制作用，表明CsA抑制肿瘤细胞增殖的一个作用机制是下调PKM2。上述结果揭示了CsA在抑制肿瘤细胞增殖作用中的一种新机制，提示其在乳腺癌及其他恶性肿瘤的辅助治疗上可能有潜在的应用价值，可能为开发恶性肿瘤治疗的新方法和新途径提供思路。

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致谢

引言

第一部分：CsA抑制乳腺肿瘤细胞增殖并诱导细胞坏死

第二部分：CsA通过下调乳腺肿瘤细胞PKM2的表达和活性抑制肿瘤细胞的生长

参考文献

文献综述1：M2型丙酮酸激酶及其在肿瘤生长中的作用

文献综述2：自体吞噬在肿瘤发展中的作用及其与肿瘤治疗

作者简历及在学期间所取得的科研成果