黄绿密环菌生物转化合成天麻素的研究

摘要

天麻素(gastrodin)是一种酚型糖苷类化合物，它具有显著的生物学活性和药理活性。本论文主要研究黄绿密环菌生物转化合成天麻素的转化条件优化以及产物的分离纯化，对分离得到的产物进行结构鉴定，并对合成的天麻素进行动物试验评价，研究其抗炎以及免疫调节功能，并初步研究生物转化体系中葡萄糖基转移酶的酶学性质，为后续深入研究和调控天麻素生物合成提供试验依据。
　　 首先研究建立转化体系中天麻素和对羟基苯甲醇的检测方法，确定转化体系中天麻素和对羟基苯甲醇的反相高效液相色谱法(RP—HPLC)，色谱柱为Waterssymmetry C18反相柱(4.6 mm×150mm，5μm)，流动相：0.02％磷酸溶液—甲醇(体积比为5：95)，检测波长：220 nm，流速：0.5 mL/min，柱温35：℃。
　　 通过单因素实验和响应面实验设计对生物转化中的条件进行优化，确定相应的转化条件为初始pH4.5，在30 mL转化液中底物浓度为3 mg/mL，加入静息细胞量为6.5 g，添加质量分数为3％的葡萄糖和1.5％的吐温80，并对转化动力学进行相应的研究，初步构建了转化合成动力学模型。
　　 初步研究转化体系中糖基转移酶的酶活测定方法和酶学性质，测得糖基转移酶的最适反应温度为50℃，在30℃稳定性最好；糖基转移酶的最适作用pH为6，在pH为6—7范围内稳定性较好。
　　 采用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH—20等色谱分离方法相结合对转化产物进行分离纯化，分离得到的两个组分经RP—HPLC、核磁共振分析等分析证实是天麻素和对羟基苯甲醇。
　　 对合成的天麻素进行动物实验，研究其抗炎及对免疫功能的影响。研究证实合成的天麻素具有抗炎的作用，并且对正常小鼠的非特异性免疫和细胞免疫功能具有增强作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 生物转化研究概况

1.1.1生物转化及其特点

1.1.2微生物转化

1.1.3国内外微生物转化研究现状

1.2微生物转化的主要方法

1.2.1生长转化法

1.2.2静息细胞转化法

1.2.3固定法细胞生物转化法

1.2.4利用酶进行生物转化

1.2.5双水相系统转化

1.2.6离子液体转化

1.3产物分离纯化与结构鉴定

1.3.1大孔树脂分离法

1.3.2硅胶柱层析法

1.3.3高速逆流色谱法

1.3.4凝胶色谱法

1.3.5核磁共振技术

1.3.6质谱技术

1.4天麻及天麻素的研究现状

1.4.1天麻与天麻素的生理活性研究

1.4.2天麻的共生菌-密环菌的生物活性及其培养概况

1.4.3天麻素的合成研究现状及其生物转化前景

1.5本论文研究目的及内容

第二章 生物转化体系中天麻素和对羟基苯甲醇定性定量检测方法的建立

2.1材料与方法

2.1.1材料与仪器

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1 TLC色谱图分析

2.2.2 RP-HPLC色谱图

2.2.3线性考察及检出限

2.2.4精密度和稳定性考察

2.2.5样品分析及回收率实验

2.3本章小结

第三章 天麻素生物转化条件优化及其转化动力学研究

3.1材料与方法

3.1.1菌种

3.1.2试剂与主要材料

3.1.3仪器与设备

3.2主要培养基

3.3实验方法

3.3.1薄层层析(TLC)

3.3.2天麻素的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)

3.3.3葡萄糖的测定

3.3.4静息细胞制备

3.3.5样品处理方法

3.3.6转化合成天麻素的条件优化研究

3.3.7转化动力学研究及数学模型构建

3.4结果与分析

3.4.1葡萄糖标准曲线

3.4.2细胞加量对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.3底物加量对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.4 pH对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.5表面活性剂对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.6细胞生长时间对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.7葡萄糖含量对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.8装液量对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.9转化温度对天麻素产量和葡萄糖转化率的影响

3.4.10中心组合试验设计

3.4.11 生物转化过程分析与转化动力学研究

3.5本章小结

第四章 生物转化体系中葡萄糖基转移酶的初步研究

4.1材料和方法

4.1.1菌种

4.1.2试剂与材料

4.1.3仪器

4.2实验方法

4.2.1粗酶液制备

4.2.2溶液配置

4.2.3酶活测定方法

4.2.4酶学性质研究

4.3结果与分析

4.3.1葡萄糖基转移酶的最适反应温度

4.3.2葡萄糖基转移酶的热稳定性分析

4.3.3葡萄糖基转移酶的最适pH

4.3.4葡萄糖基转移酶的pH稳定性

4.4本章小节

第五章 黄绿密环菌转化产物的分离纯化及其结构鉴定

5.1材料和方法

5.1.1试剂与主要材料

5.1.2仪器与设备

5.2实验方法

5.2.1硅胶柱色谱分离方法

5.2.2葡聚糖凝胶Sephadex LH-20分离方法

5.2.3半制备液相色谱分离方法

5.2.4核磁共振鉴定

5.3结果分析

5.4本章小结

第六章 天麻素抗炎及免疫调节的动物试验评价

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2方法

6.2结果与分析

6.2.1天麻素对小鼠耳廓肿胀度的影响

6.2.2天麻素对小鼠棉球肉芽肿重量的影响

6.2.3天麻素对巨噬细胞吞噬功能的影响

6.2.4天麻素对淋巴细胞转化的影响

6.2.5天麻素对NK细胞活性的影响

6.3本章小结

第七章 总结与展望

7.1主要结论

7.2后续研究展望

参考文献

致 谢

个人简历、硕士期间主要学术成果