大鼠哮喘模型肺组织toll样受体7基因mRNA表达水平的变化

摘要

近几十年来，哮喘是儿科呼吸道所有疾病中发病率增长最快的疾病之一，全世界学者对它的研究日益增加，发现了越来越多的与哮喘相关的因素，对哮喘的发病机制、疾病发展因素以及治疗上都有了更深的认识，但到目前为止，还没有完全明确哮喘的发病机制，也没有一种能够彻底治愈哮喘的治疗方案。人类Toll样受体(TLRs)是近年来发现的一类信号传导跨膜受体，可以识别、结合病原体相关分子模式(PAMP)，引发一系列信号转导，导致炎性介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用，并且能使抗原提呈细胞(APCs)识别病原体、产生刺激信号而启动获得性免疫反应，因此TLRs是人体先天免疫和获得性免疫的桥梁。TLR7作为TLRs家族中重要的成员，在生理、病理中均起着重要的作用，维持它的正常功能对机体的健康非常重要，功能减低或者功能过度增强都会对机体产生损害，造成相关疾病，如Molller-Larsen S等对它们的功能进行研究，提示了TLR7和TLR8两个受体在支气管哮喘(以下简称哮喘)中有着重要的作用机制。DuQ.等发现在大鼠哮喘模型中，Imiquimod(一种TLR7的配体)能抑制气道的重塑。Camateros P等发现大鼠模型中TLR7/8配体S28463阻止了慢性哮喘引起的气道重塑。Moisan J等发现在MyD88依赖和非MK2依赖的过敏性哮喘中，TLR7的配体能够防止由过敏原引起的气道高反应和嗜酸细胞增多症，作者提示TLR7的激活在过敏性哮喘中有治疗作用。Roponen M等学者选择TLR7诱导的粘病毒抵御蛋白A、2'5'-寡腺苷酸合成酶mRNA表达和IP-10( interferon-gamma inducible cytokineprotein10)蛋白水平三项功能性指标，研究显示经过TLR7激动剂激活后，哮喘患者这些指标含量明显比健康人低，同时发现血清总IgE与IP-10呈负相关，这些相关性仅出现于TLR7激活后，而不出现于TLR3激活，作者提示哮喘青少年中的TLR7功能较健康人降低了。以上资料表明，TLR7是与哮喘是非常密切的相关因子，但是Roponen M等学者仅仅对这三个指标的作了研究，而TLR7激活后，通过胞质的TIR功能区向胞内传递信号，引起一系列级联反应，激活NF-1B等转录因子，引起多种炎性细胞因子的分泌，如IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等，这些因子的改变他们则没有作相关研究，并且TLR7本身在哮喘中的表达如何，则无相关文献报道。NF-kB作为TLR7的下游因子，而且也是与哮喘关系密切，所以本次研究我们一并对它与TLR7进行观察。
　　 目的：采用卵白蛋白(OVA)雾化吸入致敏激发法复制哮喘大鼠模型，观察哮喘模型大鼠肺部组织TLR7和核转录因子NF-kB基因mRNA的表达水平，以及地塞米松(dexamethasone，Dex)干预前后哮喘模型大鼠肺部组织TLR7和核转录因子NF-kB基因mRNA的表达水平变化，探讨TLR7在哮喘发病和皮质激素治疗哮喘中的机制，为进一步探讨哮喘的防治方法奠定一定的基础。
　　 方法：⑴27只wister大鼠随机分为3组：哮喘组：大鼠通过OVA腹腔注射、雾化吸入致敏激发法复制哮喘大鼠模型，致敏后第22天开始给予生理盐水5ml/kg口服灌胃，一日一次，连续5天。干预组：大鼠通过OVA腹腔注射、雾化吸入致敏激发法复制哮喘大鼠模型，致敏后第22天开始给予地塞米松5mg/kg口服灌胃，一日一次，连续5天。对照组：大鼠予以生理盐水腹腔注射和雾化吸入，第22天后予生理盐水5ml/kg灌胃，一日一次，连续5天。于末次灌胃后，用腹腔注射2％戊巴比妥钠2.3ml/kg麻醉后处死大鼠，留取标本以备相关检查。将右侧肺组织迅速放入-80℃冰箱用作real time PCR测定。左侧肺组织以中性福尔马林固定，以备病理检测用。⑵采用TRizol法抽提总RNA，逆转录后，应用Takara公司SYBR Green试剂盒对肺组织TLR7和NF-kB的mRNA水平进行检测。⑶中性福尔马林固定组织脱水后予二甲苯透明，用石蜡包埋切片，最后用HE染色和Giemsa染色，进行病理观察。
　　 结果：①哮喘组出现气促等哮喘类似表现；病理发现气道壁增厚、分泌物增加、嗜酸性粒细胞浸润等，符合哮喘表现。②哮喘组大鼠肺组织中TLR7mRNA表达显著高于对照组(P<0.001)；Dex干预后TLR7mRNA的表达明显下降(P=0.004)，但仍然显著高于对照组水平(P<0.001)。③哮喘组大鼠肺组织中NF-kB mRNA表达显著高于对照组(P=0.001)；Dex干预后NF-kB mRNA的表达明显下降(P=0.006)，但仍然显著高于对照组水平(P=0.008)。
　　 结论：⑴哮喘组大鼠肺组织中TLR7基因的表达显著升高，可能是哮喘发病机制之一。⑵Dex治疗后TLR7基因的表达明显下降，但仍然明显高于对照组，提示Dex虽然可以使哮喘大鼠TLR7基因水平有效降低，但不能使之降至正常水平。⑶NF-kB与TLR7mRNA变化趋势相同的结果，提示TLR7在哮喘中的作用可能通过NF-kB介导。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1引言

2对象与方法

2.1实验主要仪器和试剂

2.2研究对象

2.3方法

2.4统计学处理

3结果

3.1哮喘症状

3.2病理检查

3.3 Real time PCR分析肺组织TLR7和NF-κB基因表达水平

4讨论

5结论

参考文献

综述 Toll样受体7在生理与病理中的作用

作者简历及在学期间发表的文章

发表论文一

发表论文二