Shh蛋白在小鼠肢芽上的表达研究

摘要

目的：先天性多指(趾)(PPD)是一种常见的肢体畸形病征，临床表现主要为超出正常数目的手指(脚趾)赘生，在新生儿中的发生率居于各类肢体畸形之首。多指畸形除了独立发生外，还可以作为一些综合征的部分症状而伴随出现。轴前多指(趾)为发生在肢体桡(胫)侧的多余指(趾)，按照受累指(趾)发生部位，可划分为4个亚型(I-IV)，分别代表二指节拇指多指、三指节拇指多指、食指多指与多指并指。轴前多指(趾)家系大多为常染色体显性遗传(AD)，从简单的三指节拇指单个指骨增加直至完整的额外指(趾)的产生，患病个体表型有明显差异。指(趾)的发育过程是一个图式发育过程，在这个过程中，Shh( SoIuc hedgehog)作为ZPA区的形态发生蛋白起着重要的作用。有报道表明Shh通过扩散影响第二指(趾)的发生，而三到五指(趾)的发育不需要通过蛋白的扩散，第一指(趾)的发生不需要Shh的参与。Shh异位表达在肢芽前部就会出现多指现象，表现为先天性多指(趾)。通过对轴前多指家系血清进行连锁分析和单倍型构建，将该家系的致病位点定位在染色体7q36上的1.7cM范围内，并且通过遗传分析排除了shh基因自身序列改变致病的可能。ZPA调控序列(ZRS)位于染色体7q36的LMBR1内含子5上，其基因位点发生突变后，影响Shh在肢芽上的表达。正常情况下，Shh只表达在肢芽后部，PPD突变的个体中Shh在肢芽前后部都有表达。本项目以小鼠为研究对象，研究胚胎发育时Shh在正常肢芽上的表达状况。以此为基础，将突变后的ZRS基因导入小鼠胚胎干细胞中，研究突变后的小鼠Shh表达状况和突变后的小鼠肢芽生长情况。
　　 方法：将适龄的ICR小鼠进行交配，次日检查，将产生阴栓的母鼠标记为E0.5天，E8.0天开始进行解剖取胚，E8.0-E12.5天进行整胚免疫组化染色，E12.5-E16.5天进行切片免疫组化染色，染色后的切片在显微镜下进行拍片。对Shh质粒扩增后抽提，进行酶切鉴定和电泳鉴定。
　　 结果：E8-E12.5天的小鼠全胚免疫组化棕黑色的部分表示的是阳性，黑色部分越大，阳性率越高。结果E10天时Shh开始有表达，E10.5天时表达量逐渐增多，E11天时在肢芽后部大量表达，E12天时表达量减少，E12.5天时已检测不出Shh的表达。E12.5-E16.5天的胚胎为切片免疫组化，Shh在E12.5-E16.5天时免疫组化染色结果都是阴性。电泳鉴定结果获得了清晰的Shh质粒酶切片段电泳图。
　　 结论：本研究运用整胚免疫组化和切片免疫组化相结合的方法，得到了Shh在各个时期的胚胎肢芽上的表达图，Shh在小鼠胚胎发育的E10-E12天在肢芽后部有表达。

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文摘

英文文摘

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致谢

引言

实验主要仪器及试剂

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 Shh在指发育过程中的作用及其表达的调节

作者简历及在学期间所取得的科研成果