广适性籼稻继代培养基的研制及其高效农杆菌转化体系的建立

摘要

籼稻是我国水稻的主要栽培种，其高效的遗传转化和大规模的转基因新品种培育对确保我国未来的粮食安全将具有重大的战略和现实意义。本论文选用了具代表性强，基因型差异大的5个籼型水稻品种93-11、明恢63、307S、槟榔红和893为实验材料；通过培养基中营养成分的调整，筛选出了适合籼稻愈伤继代的培养基，并在此基础上开发出高效的籼稻遗传转化体系。主要结果如下：
　　 1、利用每毫升添加2mg2,4-D的MS基本培养基诱导5个籼稻品种的成熟胚都获得了生长状况良好的初生愈伤，表现为颜色鲜黄，外表干燥不粘稠，质地紧密结实，细胞质浓厚。
　　 2、以MS，N6和B5基本培养基为参考，对继代培养基的无机盐大量、微量元素，有机成分，激素配比和氨基酸含量进行了系统的优化，筛选出适合籼稻愈伤继代培养的继代培养基WA（MS大量元素和N6有机成分，5xB5微量元素，0.5g/l glutamine，2.8g/l proline）。将供试的5籼稻个品种的初生愈伤分别转移到MS、N6、B5和WA培养基中进行定量的比较分析，结果显示，5个品种的初生愈伤经WA培养基继代后的胚性愈伤生长率及其绿苗分化率都明显高于MS、N6和B5培养基。ANOVA方差分析表明，在不同品种间和继代培养基间统计出的愈伤生长率和绿苗分化率都存在显著差异（P<0.01）。
　　 3、潮霉素的抗性测试表明，93-11和307S在50mg/l，明恢63在60mg/l，槟榔红和893在75mg/l的潮霉素浓度下，其愈伤组织停止生长。因此，对于相应的供试籼稻品种而言，这些潮霉素浓度是有效的筛选浓度。
　　 4、5个籼稻品种的初生愈伤经WA培养基继代培养及基因转化后的潮霉素筛选，都成功地获得了抗性愈伤。随后的GFP绿色荧光信号检测和hph扩增验证证实，其两者的阳性率在供试品种93-11、明恢63、307S、槟榔红和893上依次分别为4.1％/2.7％、36.8％/25.0％、10.5％/8.5％、37.1％/34.3％和43.8％/33.9％，不同的基因型之间存在显著差异。就愈伤的生长状况来讲，5个籼稻品种的抗性愈伤均显现出活力旺盛、质地致密和细胞质浓厚的特点，反应其具有较强的胚性。
　　 5、基于优化改良的WA继代培养基，建立了高效的籼稻遗传转化体系。遗传转化测试表明，5个籼稻品种的再生苗的PCR检测阳性率都在70％以上，平均达85％左右：以接种愈伤数为基准统计的转化率分别为：93-11的2.7％，明恢63的20.2％，307S的8.5％，槟榔红的24.0％和893的25.6％。
　　 所有这些结果都证明应用本研究优化研制的WA培养基进行愈伤继代和遗传转化，对供试的5个籼稻品种是广泛适用的。