细胞周期调控蛋白cyclin D1基因靶向microRNAs的预测、系统验证及西洋参提取物处理人乳腺癌细胞的表达谱分析

摘要

本论文的研究分两个部分。第一阶段基本围绕害虫生防真菌遗传转化体系的关键因素开展研究，目的是优化球孢白僵菌芽生孢子转化体系，提高转化效率，以服务于生防真菌的基因操作和菌种（株）的分子定向选育。第二阶段的工作是执行教育部的博士研究生交流计划，在美国南伊利诺斯大学开展合作研究，由美国的合作导师莫寅元副教授安排从事肿瘤发生发展microRNA(miRNA)调控机制研究，开展了miRNA靶基因搜索与验证、miRNA表达谱分析两方面的工作。主要结果如下：
　　 CCND1基因靶向miRNA的预测与双荧光素酶报告基因系统验证基于miranda软件(http://www.microRNA.org)的预测，克隆到58种pre-miRNA中的51种CCND1基因靶向miRNA，通过表达载体构建(pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP)和真核细胞表达，经实时荧光定量RT-PCR检测，发现其中的45种pre-miRNA的表达水平相对较高。7种miRNA可使双荧光素酶报告基因系统中荧光素酶相对活性下将35％以上，显示miranda软件预测结果的阳性率约为16％。在7种可下调荧光素酶表达的miRNA中，miR-16、miR-34a、miR-195和miR-424a对CCND1基因的沉默作用已见报道，而miR-19a、miR-155和miR-503为首次发现。比较miRanda、TargetScan和PicTar软件预测的CCND1基因靶向miRNA，三种软件预测结果的交集阳性率最高，但仅由miRanda软件预测的miRNA中仍存在可能的靶向miRNA，突出了对其进行实验验证的必要性。预测结果的较低阳性率，揭示了miRNA/mRNA相互作用的复杂性。
　　 CCNDI基因靶向miRNA的系统验证应用Western杂交和实时荧光定量RT-PCR检测双荧光素酶报告基因系统筛选到的3种CCND1基因靶向miRNA(miR-19a,miR-155和miR-503)对人头颈部肿瘤细胞UMSCC10B表达CCND1蛋白和mRNA的影响。结果显示，miR-503在UMSCC10B细胞中可显著降低CCND1蛋白和mRNA的表达。为了验证miR-503沉默CCND1基因的特异性，使用anti-miR-503和荧光素酶报告基因载体共转染人胚肾细胞293T，结果导致荧光素酶相对活性显著上升，与miR-503转染时相反。两个miR-503预测靶位点被敲除后，双荧光素酶报告基因系统检测未见相对荧光素酶活性的明显变化。这证明miR-503可通过与这两个位点的特异结合沉默CCND1基因。而且，miR-503可在UMSCCIOB细胞中降低S期细胞比例和抑制细胞生长，故推测miR-503可能为抑癌基因。
　　 西洋参提取物处理人乳腺癌细胞的miRNA表达谱分析用0.5、0.75和1.0 mg/mL西洋参提取物分别处理MDA-MB-231人乳腺癌细胞，在不同时间点观察可见细胞形态发生较明显的改变，表现为细胞皱缩，胞质粗糙。从0.5 mg/mL西洋参提取物处理24h后的样品和对照样品中提取总RNA，逆转录用于实时荧光定量PCR阵列。在检测的95种肿瘤相关miRNA中，发现miR-145和miR-205的表达分别上调3.2倍和4.5倍，miR-196a的表达下调82％。
　　 限制性内切酶介导法和电击法优化球孢白僵菌芽生孢子转化体系采用限制性内切酶介导整合(REMI)和电击法优化球孢白僵菌芽生孢子转化体系。在萨氏培养液中振荡培养48h后转到合成培养基GM(w/v:4％葡萄糖、0.4％ NH4N03、0.3％ KH2P04和0.3％ MgS04)中培养_<24 h，所获芽生孢子用100 UHindlII或XbaI介导含草丁膦(PPT)抗性基因bar的1ug质粒，具有良好的转化效果。同样孢龄的芽生孢子也适合电击转化，电场强度优化为10 kV/cm。优化的REMI法和电击法可使转化效率分别提高至38.5(±4.4)和52.7(±4.8)个转化子/ug DNA，而对照PEG法的转化效率仅为22.2(+1.7)个转化子/ug DNA，转化效率提高了73％和137％。转化子经连续三代无选择压培养后仍能在400 ug/mL PPT的察氏培养基平板上生长，而亲本菌株未见抗性。PCR反应和Southern杂交鉴定随机选取的10个REMI和电击转化子，目的基因均成功插入其基因组中。
　　 综上所述，本研究的主要成果和创新点，一是系统验证了CCND1基因靶向miRNA，筛选出特异性沉默CCND1基因的miRNA-503，推测其为抑癌基因；二是通过实时荧光定量PCR阵列检测到西洋参提取物诱导的miR-145、miR-205和miR-196a表达谱的明显差异；三是使用REMI法和电击法优化了球孢白僵菌芽生孢子转化体系。这些结果有助于miRNA/mRNA相互作用的验证、天然药物分子机理和生防真菌的遗传操作的研究。

目录

文摘

英文文摘

资助

致谢

1 microRNA (miRNA)与肿瘤关系及其研究方法进展

1.1 miRNA与肿瘤

1.1.1 miRNA的生物合成与作用机制

1.1.2 miRNA与肿瘤发生

1.1.3 miRNA与肿瘤细胞增殖凋亡

1.1.4 miRNA与肿瘤细胞侵袭转移

1.1.5 miRNA与肿瘤细胞耐药性

1.1.6 miRNA与肿瘤预后

1.2 miRNA靶基因鉴定

1.2.1 miRNA靶基因预测

1.2.2 miRNA靶基因验证

1.3 miRNA表达谱分析

1.3.1 肿瘤miRNA表达差异的可能原因

1.3.2 miRNA表达谱与肿瘤鉴定

1.3.3 miRNA表达谱分析方法

1.4 研究目标与意义

2 CCNDI基因靶向miRNA的预测与双荧光素酶报告基因系统验证

2.1 材料

2.1.1 细胞、菌株与质粒

2.1.2 试剂

2.2 方法

2.2.1 miRNA真核表达载体构建

2.2.2 荧光素酶报告基因载体Luc-CCND l-3’-UTR构建

2.2.3 DNA转染

2.2.4 miRNA表达的实时荧光定量RT-PCR检测

2.2.5 CCND1基因预测靶向miRNA的双荧光素酶报告基因系统检测

2.3 结果与分析

2.3.1 miRNA真核表达载体构建

2.3.2 荧光素酶报告基因载体Luc-CCND l-3'-UTR构建

2.3.3 CCND1基因靶向miRNA筛选

2.4 讨论

3 CCND1基因靶向miRNA的系统验证

3.1 材料

3.1.1 细胞、菌株与质粒

3.1.2 试剂

3.2 方法

3.2.1 CCNDl蛋白的Western杂交分析

3.2.2 CCNDl mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR检测

3.2.3 miR-503靶位点敲除荧光素酶报告基因载体Luc-CCND l-3'-UTR-2-d构建

3.2.4 RNA转染

3.2.5 靶向miRNA特异性与靶位点的双荧光素酶报告基因系统检测

3.2.6 细胞周期检测

3.2.7 细胞生长检测

3.3 结果与分析

3.3.1 CCND1蛋白和mRNA检测

3.3.2 miR-503靶位点敲除荧光素酶报告基因载体构建

3.3.3 miR-503作用特异性和靶位点检测

3.3.4 miR-503对细胞周期和细胞生长影响检测

3.4 讨论

4 西洋参提取物处理人乳腺癌细胞的miRNA表达谱分析

4.1 材料

4.1.1 细胞

4.1.2 试剂

4.2 方法

4.2.1 西洋参提取物处理浓度和时间确定

4.2.2 西洋参提取物处理及样品RNA提取与逆转录

4.2.3 实时荧光定量PCR阵列检测miRNA表达谱

4.3 结果与分析

4.3.1 西洋参提取物处理浓度和时间确定

4.3.2 西洋参提取物处理miRNA表达谱检测

4.4 讨论

5 球孢白僵菌芽生孢子转化体系的优化

5.1 材料

5.1.1 菌株与质粒

5.1.2 试剂

5.2 方法

5.2.1 感受态芽生孢子的制备

5.2.2 REMI介导

5.2.3 电击

5.2.4 转化子稳定性测试

5.2.5 转化子基因组DNA提取

5.2.6 转化子PCR鉴定

5.2.7 转化子Southern杂交鉴定

5.3 结果与分析

5.3.1 REMI转化条件优化

5.3.2 电击转化条件优化

5.3.3 转化子中bar基因检测

5.4 讨论

6 结语

参考文献

附录：攻读学位期间的主要成果