疣粒野生稻(Oryza granulata)内生真菌资源挖掘、系统发育分析和功能初探

摘要

非禾草内生麦角菌(non-clavicipitaceous grass endophytes)具有高度遗传多样性和功能多样性,已经成为当前菌物学研究的热点和主题。挖掘内生真菌资源对研究高等真菌生态学、进化机制等基础理论和应用开发均有重要的科学意义。从珍稀濒危植物或具有特殊进化历程、生存策略的植物中分离内生真菌极有可能获得种类新颖、功能特殊的宿主专一性类群。本篇论文对分布在云南西双版纳的濒临灭绝的禾本科植物--疣粒野生稻(Oryza granulata)的内生真菌资源进行了“生物勘探”。结合分离培养方法和免培方法,从形态水平(显微观察)、宏观生态水平(多样性参数计算和物种累加曲线预测)、生理水平(活体接种和活性测试)和分子水平(系统发育分析和环境PCR)等不同层次对疣粒野生稻内生真菌的种群结构组成、多样性特征、重要类群的系统发育关系和部分菌株的生物学功能进行了分析。在2007-2009年9月份,分别进行三次野外调查,共采集样品40株。
　　 主要结果:
　　 1)组织染色法证实了内生真菌菌丝在叶片和根系组织的分布,胞间或胞内定殖:根系中存在多种真菌侵染结构特征:“微菌核”(microsclerotia)可以充满单个皮层细胞或零星分布在多个细胞中,同时有大量暗色有隔菌丝平行分布在皮层细胞,这些特征表明了暗色有隔内生菌的存在(dark septate endophytes,DSEs);有些菌丝顶端细胞往往膨大、突起,形成不规则的类似附着孢的结构;此外还能观察到类似厚垣孢子的聚集。但是,并没有观察到典型菌根真菌的侵染结构。
　　 2)通过分离培养,共获得根系内生真菌菌株107株,茎杆74株和叶片组织78株(包括叶鞘)。利用经典形态学分类特征、“形态型”划分和分子生物学方法对菌株进行鉴定。结果表明,叶片组织内生真菌侵染频率相对较高(48.1％),其优势种群是炭角菌(Xylariaceae)和节菱孢霉(Arthrinium spp.);而根系和茎杆组织内生真菌侵染频率较低(分别为15.7％和11.7％)且没有明显的优势种群,绝大多数是单个种(singleton)。部分菌株在PDA或MEA培养基培养1-2周可产生无性态繁殖结构,包括Penicillium、Aspergillus、Cylindrocarpon、Fusarium、Phomopsis、Colletotrichum和Paecilomyces等;不产孢的菌株根据培养性状划分为多个“形态型”,然后对代表性菌株进行ITS序列测定,通过序列比对在GenBank数据库中获得最佳匹配记录,大致确定分类地位(目、科或属的水平)。BLAST结果表明很多菌株(尤其是茎内生菌)的ITS序列与已知菌物序列的相似度较低(83％-94％),可能代表了潜在的新种或更高的分类单元。
　　 从分类地位看,绝大多数菌株属于子囊菌门中的座囊菌纲(Dothideomycetes)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)和散囊菌纲(Eurotiomycetes)。根、茎和叶片组织内生真菌组成有明显差别,其中根系内生菌主要有座囊菌纲和散囊菌纲组成;茎内生菌主要由座囊菌纲和粪壳菌纲组成;而叶片内生菌主要由粪壳菌纲组成。此外也分离到4株担子菌,其中3株属于无致病性的双核丝核菌(Binucleate Rhizoctonia sp,有性阶段为Ceratobasidium)和1株小皮伞属(Marasmius)真菌。格孢腔目(Pleosporales)、巨座壳科(Magnaporthaceae)和节菱孢霉(Arthrinium)真菌在不同组织中均有分布而且基于ITS的系统发育分析也揭示了其种类丰富的特点。同时,野生稻内生真菌种群的年度变化很大,仅有少数种类重叠。
　　 3)利用环境PCR方法,提取根系总基因组DNA,利用真菌特异性引物ITS1F和ITS4扩增真菌ITS片段,进而建立ITS基因克隆库。最终获得186个阳性克隆(无嵌合体结构)的序列,以90％相似度为分类单元界限,可以分为35个系统发育型(phylotypes)。检测频率最高的克隆属于未知的担子菌(25.1％),而且60.2％的克隆序列最佳BLAST结果均与分类地位尚不明确的记录匹配。
　　 4)从根系中分离到两株巨座壳科真菌,通过比较产孢结构、分生孢子、培养性状等形态特征,并分析ITS系统发育树,将其定名为一新种--稻镰状瓶霉(Harpophoraoryzae Z.L.Yuan,C.L.Zhang& F.C.Lin,sp.nov.)。在1/2MS培养上,接种Harpophoraoryzae可以显著促进栽培水稻的生长并提高其生物量,组织染色观察也证明H.oryzae能成功定殖在根系皮层细胞中。
　　 5)从茎杆中分离到两种Muscodor属(炭角菌科)真菌,这是首次在我国发现该属真菌。ITS、RPB2基因序列分析和系统发育结果表明,S13-1-2菌株与已报道的模式种M.albus(白色产气霉)序列100％相似;S18-3-1菌株的ITS序列与M.yucatanPnsis相似性有98％,但RPB2序列与M.albus的差异高达17％;而且在菌落特征、生长速度等方面与M.yucatanensis也有明显差别,因此将其定名为一新种--云南产气霉(Muscodoryunnanense Z.L.Yuan,C.L.Zhang& F.C.Lin,anam.sp.nov.)体外抑菌试验表明,M.albus S13-1-2和M.yunnanense S18-3-1能产生挥发性抑菌物质,对多种植物病原真菌的生长有强烈的抑制效果,甚至是致死作用。M.yunnane S18-3-1的活性比M.albus S13-1-2更强。
　　 6)生物学功能初步分析表明,内生双核丝核菌R15-3-1预处理栽培水稻幼苗可以提高水稻对纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的抗病能力。
　　 结论：概括与科学意义:
　　 1)疣粒野生稻根系和茎杆组织内生真菌多样性极其丰富。Exophiala、Cladophialophora、Periconia macrospinosa和Rhizoctonia等代表了根系潜在的DSEs,但需要进一步的试验证据证明:Harpophora oryzae可以作为栽培水稻根系的DSE;疣粒野生稻的内生真菌的遗传多样性比已报道的栽培稻品种要丰富,表明在原产地野生状态下的植物可能蕴含物种更丰富、更新颖的功能性菌株。
　　 2)根系染色观察和PCR方法均未检测到菌根真菌的存在,至少说明在某些特定生境下,内生真菌扮演着与菌根真菌同等重要的角色。
　　 3)格孢腔内生真菌在草本植物中(也包括禾本科植物)较常见:巨座壳和节菱孢霉在禾本科植物中更为普遍,显示内生真菌在种类组成具有一定的宿主特异性(至少在植物“科”的水平上)。而且其中一部分菌株很可能代表了新的分类地位,这对于相关类群的进化生物学与整体系统生物学研究具有重要的参考价值。
　　 4)“单个种”或稀有种在根系和茎杆组织中较为常见,这些种类并非是由于样品数量、随机侵染宿主或操作污染造成的,而是严格意义上的“真正内生菌”(trueendophytes),与宿主经历了长期的协同进化(不具有强致病性),因此在分析内生真菌生物多样性或功能多样性时,不应该将这些种类剔除或忽略。
　　 5)内生真菌种群具有明显的年度变化,因此在系统挖掘某一类植物内生真菌资源时,在不同年份、不同生长季节分别取样有可能获得更丰富的内生真菌类群,从而有助于更清晰认识植物内生真菌的一系列基础生物学特性。
　　 6)环境PCR方法通常能检测到更多的担子菌,而培养方法获得的菌株绝大多数属于子囊菌。因此常规分离培养方法获得的类群并不能反映植物内生真菌种群结构的真正面貌,可以尝试采用不同的分离方法、培养技术来“捕获遗漏的真菌”。
　　 7)产气霉Muscodor可能有更广的地理分布范围,从高纬度植物中寻找更多新的产气霉种类对全面认识这种特殊的严格内生菌的生态、进化等有重要科学意义。