代谢工程改造的链霉菌生物合成去甲基C-1027和iso-Migrastatin的研究

摘要

本文对两种代谢工程改造的链霉菌生产两种重要的次级代谢产物进行了系统的研究。
　　 C-1027是Streptomyces globisporus产生的一种新型的大分子蛋白类抗肿瘤化合物，属于烯二炔类抗肿瘤抗生素。采用遗传操作技术使C-1027产生菌S.globisporus中的sgcD4基因失活得到sgcD4基因阻断的突变株SB1052，可以生产新型C-1027衍生物——去甲基C-1027;而C-1027的生产可以通过sgcD4基因额外补全恢复。这些结果不但进一步确认了sgcD4基因确实编码一个O-甲基转移酶，而且明确突出了通过合理性设计发展结构复杂的天然产物（如烯二炔类化合物）结构多样性的优势。然后通过系统的优化设计来提高去甲基C-1027这种新型抗生素的发酵产量。首先建立了方便易行的生物检测去甲基C-1027的方法；经过优化，最终得到了一个去甲基C-1027发酵生产的优良配方，去甲基C-1027的产量在摇瓶发酵和10L发酵罐上批次发酵达到95mg/L左右，提高到优化前的7倍，并达到了野生菌产C-1027(50～100mg/L)的水平。以上研究说明，将现代组合生物合成的方法和传统的发酵优化相结合、以提高工程菌中新型代谢物的效价是一个非常有效的策略。这为扩大天然产物库以便于新药发展提供了一个新的有效手段。
　　 iso-Migrastatin(iso-MGS)是由Streptomyces platensis NRRL18993生产的一种戊二酰亚胺类抗生素，是一种非常优良的抑制肿瘤转移的化合物。iso-MGS的生物合成基因簇已经被成功克隆，并且iso-MGS已经在5种链霉菌宿主中成功得到异源生物合成。然而，相对于野生菌，iso-MGS的异源生物合成产量非常低。
　　 本文对五个异源工程菌的iso-MGS发酵生产进行全面系统研究。首先对五个异源工程菌在三种培养基中的发酵进行对比分析，结果显示，工程菌SB11001和SB11002更适合支持iso-MGS的发酵生产，R2YE发酵培养基适合支持iso-MGS的发酵生产。然后对培养条件进行优化，结果为种子培养基选用R2YE培养基，培养时间72h，接种量8％(v/v)，发酵培养收获时间为5天，发酵液初始pH值6.5。在此基础之上，进行发酵培养基成分的优化，所有五个异源工程菌的生产效价得到了大大提高，分别提高了3～18倍，SB11001最高产量达128.6mg/L。设计了两种R2YE与B2的混合培养基，来同时达到iso-MGS高产和产物单一的目的，通过探索，SB11001的iso-MGS发酵产量达到186.7mg/L。此外，为了验证碳酸氢盐和iso-MGS发酵生产效价之间的的关系，在培养基中添加不同浓度的碳酸氢钠，结果当NaHCO3添加浓度为2g/L时，iso-MGS发酵产量提高到了213.8mg/L。
　　 利用实时定量RT-PCR技术的优势，将其应用于检测异源工程菌S.albus SB11001的iso-MGS的11个生物合成基因（mgsA-mgsK)的mRNA在四种不同培养基下转录水平的差异。建立了一套行之有效的链霉菌实时定量RT-PCR实验流程；首次对比了基因转录水平与iso-MGS生产之间的联系，结论是整个基因簇的同步转录、而不是个别基因大量转录对iso-MGS的生产更重要，而且基因在72h的转录量对于iso-MGS的最终产量非常重要。这些结果揭示了异源合成对iso-MGS生产的发展潜力以及iso-MGS的生物合成机制，并为iso-MGS的大规模生产和进一步临床发展奠定了基础。