蝶蛹金小蜂毒液抑制菜粉蝶蛹免疫反应的分子机理研究

摘要

有关寄生蜂及其寄主昆虫之间的相互关系的研究备受重视，究其原因主要有两点：第一，研究者对于寄生蜂-寄主间相互作用的机理十分感兴趣；其次，寄生蜂作为生物防治的资源已被广泛的应用于现代农业的可持续发展中。蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum(膜翅目Hymenoptera：金小蜂科Pteromalidae)为聚寄生性内寄生蜂，其雌蜂于产卵过程中将毒液注入寄主体内，且其生殖系统中无多分DNA病毒存在，毒液为其关键因子，用于调控寄主。因此，蝶蛹金小蜂及其寄主菜粉蝶Pieris rapae(鳞翅目Lepidoptera：粉蝶科Pieridae)蛹之系统为深入研究内寄生蜂毒液影响寄主蛹生理学反应的机理提供了极佳的模型。蝶蛹金小蜂毒液能够抑制寄主的免疫反应，但有关其抑制作用的内在机理仍不十分清楚。有鉴于此，本论文就其毒液抑制菜粉蝶蛹免疫反应的分子机理开展系统研究，并取得以下主要结果：
　　 (1)明确毒液能够影响菜粉蝶蛹两个主要免疫效应器血细胞及脂肪体中的基因转录。注射毒液后1 h，我们从血细胞的正向抑制性消减杂交文库中筛选获得了217个EST克隆(共指向113个基因序列，其中62个为未知序列)，同时也从脂肪体的正向文库中筛选获得了288个EST克隆(共指向221个基因序列，其中123个为未知序列)，说明上述EST克隆所指向基因的转录水平均会被毒液下调。对已知基因序列进行功能注释，发现其分别与昆虫免疫反应、细胞骨架、细胞周期与凋亡、代谢、运输、应激反应以及转录与翻译调控等功能相关。尔后，我们又采用RT-PCR对随机选择的候选基因进行了半定量分析，验证结果表明，绝大部分候选基因的转录水平均被毒液所下调，这说明抑制性消减杂交结果是可信的。
　　 (2)明确毒液能够下调菜粉蝶蛹天蚕素及溶菌酶基因的转录水平，并能抑制其血淋巴的抗菌活性。抑菌圈测定结果表明，与对照相比，寄生或注射SephadexA-50微珠的蛹血淋巴抗菌活性显著上升，毒液对诱导后的抗菌活性存在显著的抑制作用。对正向抑制性消减杂交文库进行筛选，分别获得了编码菜粉蝶蛹天蚕素及溶菌酶的全长cDNAs。多序列比对分析结果表明，它们的推导氨基酸序列分别与其它鳞翅目昆虫的天蚕素与溶菌酶的较为近缘。rq-rtPCR(relativequantitative real time PCR)结果表明，与对照相比，经藤黄微球菌、大肠杆菌及微珠诱导后天蚕素及溶菌酶基因的转录水平明显上升，毒液对其存在明显的抑制作用。经微珠诱导后，天蚕素基因于处理后8 h达到转录高峰尔后逐渐下降，而溶菌酶基因则于处理后24 h达到转录高峰尔后逐渐下降。天蚕素及溶菌酶基因的转录存在组织特异性，它们在蛹颗粒血细胞及脂肪体中的转录水平较高。注射dsRNA(double-strand RNA)可降低两基因的转录水平，并能下调处理蛹血淋巴的抗菌活性，这表明天蚕素与溶菌酶基因的表达产物具抗菌活性。毒液抑制天蚕素及溶菌酶基因转录具有明显的时间效应，处理后0-8 h，毒液均能有效抑制两基因的转录，8 h后毒液的抑制作用逐渐丧失。同时，毒液抑制两基因的转录具有明显的剂量效应，毒液浓度越高，抑制作用越强。此外，重组表达的天蚕素及溶菌酶对蝶蛹金小蜂出蜂率无显著影响。
　　 (3)明确毒液能够下调菜粉蝶蛹原酚氧化酶激活蛋白(prophenol oxidaseactivating proteinase，PAP)基因的表达，能抑制其血淋巴原酚氧化酶(prophenoloxidase，proPO)的激活反应，但并不抑制proPO基因的表达及酚氧化酶(phenoloxidase，PO)自身的活性。PO活性测定结果表明，与对照相比，寄生并不能诱导蛹血淋巴PO活性升高，注射微珠则能诱导PO活性升高。毒液对诱导后的PO活性具有显著的抑制作用，并通过生理学实验证明，其作用靶标为proPO激活级联反应，而非PO本身。对文库进行筛选并结合RACE(Rapid amplificationof the end of the full-length cDNAs)反应，分别获得了编码菜粉蝶蛹PAP1、PAP2及proPO亚基1的全长cDNAs。多序列比对分析结果表明，它们的推导氨基酸序列分别与其它鳞翅目昆虫的PAP及proPO亚基的近缘。rq-rtPCR及westernblotting结果表明，与对照相比，经藤黄微球菌、大肠杆菌及微珠诱导后3个基因的转录与表达水平明显上升，毒液对PAP1和PAP2基因的转录与表达水平存在明显的抑制作用，而对proPO亚基1基因无显著影响。经微珠诱导后，3个基因均于处理后4 h达到转录与表达高峰尔后逐渐下降。3个基因的转录与表达存在组织特异性，其中PAP1和PAP2基因在蛹颗粒血细胞与脂肪体中的转录与表达水平较高，而proPO亚基1基因则在血细胞中的转录与表达水平较高。注射dsRNA可降低3个基因的转录与表达水平，并能下调处理蛹血淋巴的PO活性，这表明它们的表达产物参与血淋巴的黑化。毒液抑制PAP1和PAP2基因转录具有明显的时间效应，处理后0-8 h，毒液均能有效抑制两基因的转录，8 h后毒液的抑制作用逐渐丧失。同时，毒液抑制两基因的转录具有明显的剂量效应，毒液浓度越高，抑制作用越强。
　　 (4)明确毒液能够下调菜粉蝶蛹清道夫受体基因的表达，并能抑制蛹血细胞的吞噬反应。吞噬率测定结果表明，与对照相比，寄生及毒液处理能显著降低蛹血细胞的吞噬能力。对文库进行筛选并结合RACE反应，获得了编码菜粉蝶蛹清道夫受体的全长cDNA。多序列比对分析结果表明，其推导氨基酸序列分别与其它鳞翅昆虫的清道夫受体的近缘。rq-rtPCR及western blotting结果表明，与对照相比，经藤黄微球菌、大肠杆菌及微珠诱导后该基因的转录与表达水平明显上升，毒液对其转录与表达水平存在明显的抑制作用。经微珠诱导后，该基因于处理后4 h达到转录与表达高峰尔后逐渐下降。该基因的转录与表达存在组织特异性，其在蛹颗粒血细胞中的转录与表达水平较高。亚细胞定位及western blotting结果表明，该基因的表达产物被定位于颗粒血细胞的细胞质与细胞膜上，且不能被分泌至蛹血浆中，毒液可抑制该基因在颗粒血细胞中表达。注射dsRNA可降低该基因的转录与表达水平，并能下调处理蛹血细胞的吞噬与包囊能力，这表明其表达产物不仅参与细胞吞噬反应，也同时参与包囊反应。毒液抑制该基因转录具有明显的时间效应，处理后0-8 h，毒液均能有效抑制其转录，8 h后毒液的抑制作用逐渐丧失。同时，毒液抑制该基因的转录具有明显的剂量效应，毒液浓度越高，抑制作用越强。
　　 (5)明确毒液能够下调菜粉蝶蛹C型凝集素基因的表达，该基因表达水平的下调会降低蛹血淋巴的抗菌及酚氧化酶活性，以及血细胞的吞噬与包囊能力。对文库进行筛选并结合RACE反应，获得了编码菜粉蝶蛹C型凝集素的全长cDNA。多序列比对分析结果表明，其推导氨基酸序列与其它鳞翅昆虫的C型凝集素的近缘。rq-rtPCR及western blotting结果表明，与对照相比，经藤黄微球菌、大肠杆菌及微珠诱导后该基因的转录与表达水平明显上升。毒液对其转录与表达水平存在明显的抑制作用。经微珠诱导后，该基因于处理后4 h达到转录与表达高峰尔后逐渐下降。该基因的转录与表达存在组织特异性，其在蛹颗粒血细胞中的转录与表达水平较高。亚细胞定位及western blotting结果表明，该基因可能位于蛹颗粒血细胞的颗粒中表达，并能被分泌至蛹血浆中。诱导表达后8 h，血浆中的C型凝集素能与浆血细胞膜结合，毒液能抑制该基因在蛹颗粒血细胞中的表达。注射dsRNA可降低该基因的转录水平，并能下调处理蛹血淋巴的抗菌与酚氧化酶活性，以及血细胞的吞噬与包囊能力，这表明其表达产物很可能参与了寄主的非我识别过程。毒液抑制该基因转录具有明显的时间效应，处理后0-8 h，毒液均能有效抑制其转录，8 h后毒液的抑制作用逐渐丧失。同时，毒液抑制该基因的转录具有明显的剂量效应，毒液浓度越高，抑制作用越强。
　　 以上主要结果在很大程度上已充分解释了蝶蛹金小蜂毒液抑制菜粉蝶蛹免疫反应的分子机理，它们有利于提升我们对蝶蛹金小蜂/菜粉蝶蛹系统相互作用机理的认识，并为进一步深入研究提供了新视野。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

致谢

前言

第一章 昆虫先天免疫及其研究进展

1 引言

2 物理防御

3 非我识别

3.1 病原物关联的模式分子

3.2 模式识别受体介导的非我识别

4 体液免疫

4.1 抗菌肽合成

4.2 原酚氧化酶级联系统与血淋巴蛋白酶

5 细胞免疫

5.1 吞噬反应

5.2 凝集反应

5.3 结节形成与包囊反应

6 小结与展望

第二章 寄生蜂调控寄主先天免疫反应的研究进展

1 引言

2 对寄主体液免疫反应的影响

2.1 对proPO激活的影响

2.2 对抗菌肽诱导合成的影响

3 对寄主细胞免疫反应的影响

3.1 对血细胞的影响

3.2 对包囊反应的影响

4 小结与展望

第三章 毒液对菜粉蝶蛹期免疫相关基因表达的抑制作用

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试昆虫饲养

2.2 粗毒液制备

2.3 活体包囊反应测定

2.4 样品制备与总RNA分离

2.5 抑制性消减杂交文库构建及其ESTs序列测定

2.6 半定量reverse transcription-PCR(RT-PCR)

2.7 酶活性检测

2.8 统计分析

3 结果与讨论

3.1 蝶蛹金小蜂毒液对菜粉蝶蛹包囊反应的抑制作用

3.2 血细胞与脂肪体正向差异显示cDNA文库构建

3.3 菜粉蝶蛹免疫应答相关基因

3.4 菜粉蝶蛹蛋白质翻译与合成相关基因

3.5 菜粉蝶蛹解毒代谢及应激反应相关基因

3.6 半定量RT-PCK及酶活性测定结果

第四章 毒液对菜粉蝶蛹期天蚕素与溶菌酶基因表达的抑制作用

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试昆虫饲养

2.2 粗毒液制备

2.3 寄生与免疫诱导及血淋巴提取

2.4 抗菌活性测定

2.5 ESTs克隆获得与序列分析

2.6 表达模式检测

2.7 RNA干扰

2.8 毒液作用的时间与剂量效应检测

2.9 原核重组表达及活性检测

2.10 统计分析

3 结果

3.1 不同处理对菜粉蝶蛹血浆抗菌活性的诱导与抑制

3.2 Pr-cec全长cDNA筛选及其序列分析

3.3 Pr-lys全长cDNA筛选及其序列分析

3.4 免疫诱导对Pr-cec和Pr-lys基因转录的影响

3.5 免疫诱导后Pr-cec和Pr-lys基因转录的组织特异性

3.6 Pr-cec和Pr-lys基因功能验证

3.7 毒液抑制Pr-cec和Pr-lys基因转录的时间与剂量效应

3.8 Pr-cec和Pr-lys基因表达及其产物对出蜂率的影响

4 讨论

第五章 毒液对菜粉蝶蛹期原酚氧化酶级联反应的负调机制

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试昆虫饲养

2.2 粗毒液制备

2.3 原酚氧化酶的活体激活

2.4 酚氧化酶活性测定

2.5 全长cDNA序列克隆

2.6 序列拼接与分析

2.7 原核表达与抗体制备

2.8 基因表达模式检测

2.9 RNA干扰

2.10 毒液作用的时间与剂量效应检测

2.11 包囊体黑化程度测定

2.12 统计分析

3 结果

3.1 不同处理对菜粉蝶蛹血浆PO活性的诱导与抑制

3.2 Pr-PAP1全长cDNA克隆及其序列分析

3.3 Pr-PAP2全长cDNA克隆及其序列分析

3.4 Pr-PPO sub1全长cDNA克隆及其序列分析

3.5 Pr-PAP1、Pr-PAP2及Pr-PPO sub1重组表达与抗体制备

3.6 免疫诱导对基因转录与表达的影响

3.7 诱导时间对基因转录与表达的影响

3.8 诱导后基因转录与表达的组织特异性

3.9 Pr-PAP1、Pr-PAP2和Pr-PPO sub1基因功能验证

3.10 毒液抑制基因转录的时间剂量效应

3.11 毒液对包囊体黑化的抑制作用

4 讨论

第六章 毒液对菜粉蝶蛹期清道夫受体基因表达的抑制作用

1 引言

2 材料与方法

3 结果

3.1 不同处理对菜粉蝶蛹血细胞吞噬能力的诱导与抑制

3.2 Pr-SR全长cDNA克隆及其序列分析

3.3 Pr-SR的重组表达与抗体制备

3.4 免疫诱导对Pr-SR基因转录与表达的影响

3.5 诱导时间对Pr-SR基因转录与表达的影响

3.6 诱导后Pr-SR基因转录与表达的组织特异性

3.7 毒液处理对Pr-SR在血细胞中表达模式的影响

3.8 Pr-SR基因功能验证

3.9 毒液抑制Pr-SR基因转录的时间剂量效应

4 讨论

第七章 毒液对菜粉蝶蛹期C型凝集素基因表达的抑制作用

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试昆虫饲养

2.2 粗毒液制备

2.3 全长cDNA序列克隆

2.4 序列拼接与分析

2.5 原核表达与抗体制备

2.6 基因表达模式检测

2.7 基因表达产物的亚细胞定位

2.8 RNA干扰

2.9 毒液作用的时间与剂量效应检测

2.10 统计分析

3 结果

3.1 Pr-CTL全长cDNA克隆及其序列分析

3.2 Pr-CTL重组表达与抗体制备

3.3 免疫诱导对Pr-CTL基因转录与表达的影响

3.4 诱导时间对Pr-CTL基因转录与表达的影响

3.5 诱导后Pr-CTL基因转录与表达的组织特异性

3.6 Pr-CTL在血细胞中的定位及毒液处理对其影响

3.7 Pr-CTL基因功能验证

3.8 毒液抑制Pr-CTL基因转录的时间剂量效应

4 讨论

第八章 总讨论

1 昆虫先天免疫

2 寄生蜂对寄主先天免疫的调控作用

3 蝶蛹金小蜂毒液调控菜粉蝶蛹期先天免疫的模式

4 本研究创新之处

5 本研究存在的问题与不足

6 今后的研究方向

参考文献

作者简历