荧光定量PCR检测呼吸道标本中的人偏肺病毒

摘要

目的:
　　 观察比较实时荧光定量RT-PCR与直接免疫荧光检测技术检测呼吸道标本HMPV的特异性、灵敏度,旨在探讨实时荧光定量RT-PCR检测儿童HMPV方法的临床应用前景。
　　 方法:
　　 用DNAstar比对分析HMPV的全基因组序列,寻找可供PCR扩增的保守片断,分别设计引物:primerF:5'-GTCTCTTCAAGGGATTCACC-3和primerR5'-GTTGTTGTGCCTACATCTC-3,探针:TaqMan5'-FAM-CATGCTATATTAAAAGAGTCTCA-TAMRA-3'。探针的5'端由FAM标记,3'端由TAMRA标记。建立检测HMPV荧光定量PCR的方法。
　　 分别用建立的实时荧光定量RT-PCR与直接免疫荧光检测技术检测623例浙江大学医学院附属儿童医院呼吸内科病房2009年12月至2010年3月住院下呼吸道感染患儿HMPV的感染情况。比较两种方法检测儿童HMPV的特异性与灵敏度。
　　 结果:
　　 1.以HMPV作为模板进行荧光定量PCR获得阳性结果,但对其它常见呼吸道病毒(腺病毒,A型流感病毒,B型流感病毒,副流感病毒1型,副流感病毒2型,副流感病毒3型,呼吸道合胞病毒)及其它病毒PCR均阴性。
　　 2.在623例样本中直接免疫荧光法检出HMPV感染共10例,检出率1.61％。荧光定量PCR检出HMPV感染共28例,检出率4.49％,两种方法检出率有统计学差异(X2=16.05,P＜0.01)。CT值小于28直接免疫荧光法才能检出HMPV。
　　 3.直接免疫荧光法阳性者10份PCR均阳性,595份两者均阴性,18份标本直接免疫荧光法阴性PCR呈阳性,显示很好的相关性(r=0.589,P＜0.01)。
　　 4.哮喘患儿中HMPV检出率为15.4％(4/26),显著高于肺炎组(20/515,3.9％)、毛细支气管炎组(4/46,8.7％),气管支气管炎组(0/36,0％)差异具有统计意义(X2=11.217,P=0.011)。
　　 5.HMPV检出率与年龄有关,0-1岁阳性率2.2％(9/404),-3岁13.1％(16/122),-6岁3.4％(2/58),＞6岁2.6％(1/39),其中1-3岁年龄组患儿HMPV检出率明显高于其它组,统计学差异显著(X2=26.443,P=0.000)。
　　 结论:
　　 1选择HMPVN基因保守区域自行设计了一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HMPV荧光定量PCR的方法;
　　 2荧光定量RT-PCR检测HMPV敏感性明显高于直接免疫荧光法,具有快速、准确的优点;
　　 3哮喘患儿中HMPV检出率明显高于肺炎患儿;
　　 4 HMPV感染以1-3岁幼儿发生率最高。

目录

文摘

英文文摘

致谢

引言

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

1.2 材料

1.3 实验方法

2 实验结果

2.1 临床资料

2.2 PCR试验的实验室研究

2.3 PCR试验与直接免疫荧光检测的比较研究

2.4 HMPV阳性标本在不同呼吸道疾病间的分布情况

2.5 HMPV感染患儿的年龄分布

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:儿童人类偏肺病毒感染流行病学特征与诊治进展

作者简历及在学期间发表的文章